近年來(lái)，細(xì)胞療法在治療癌癥方面表現(xiàn)出優(yōu)異的療效，目前已經(jīng)有5款CAR-T療法獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)，多種同種異體CAR-T療法，T細(xì)胞受體（TCR）-T細(xì)胞療法，以及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）療法也在臨床試驗(yàn)中獲得佳績(jī)。CRISPR基因編輯技術(shù)作為一種簡(jiǎn)便有效的突破性基因編輯技術(shù)，問(wèn)世以來(lái)，不但在基礎(chǔ)科學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在臨床應(yīng)用方面也不斷獲得突破，無(wú)論是體外編輯還是體內(nèi)編輯都獲得可喜的臨床進(jìn)展。
那么，將CRISPR基因編輯技術(shù)與抗癌細(xì)胞療法結(jié)合能夠碰撞出什么樣的火花？近日發(fā)布的一篇綜述描述了使用CRISPR基因編輯技術(shù)改良抗癌細(xì)胞療法的前景。
基因編輯生成“通用型”同種異體CAR-T療法
目前獲得批準(zhǔn)的CAR-T療法都需要從患者體內(nèi)獲得T細(xì)胞，在體外進(jìn)行改造和擴(kuò)增，然后再輸回患者體內(nèi)。這種自體細(xì)胞療法的生產(chǎn)工藝耗時(shí)耗力，而且有些患者因?yàn)榧膊∵M(jìn)展速度快，或者無(wú)法提供足夠的健康T細(xì)胞而無(wú)法接受它們的治療。
解決這些局限的一個(gè)主要方向是開(kāi)發(fā)基于健康供體提供的T細(xì)胞而生產(chǎn)的同種異體的“通用型”CAR-T細(xì)胞療法。這一策略可以提前進(jìn)行細(xì)胞療法的生產(chǎn)，它們可以用于及時(shí)治療不同患者。然而，由于供體的T細(xì)胞表面表達(dá)著獨(dú)特的T細(xì)胞受體和人類白細(xì)胞抗原（HLA）。這一策略面臨的重大挑戰(zhàn)之一是患者的免疫排斥（患者免疫系統(tǒng)攻擊輸入的細(xì)胞療法）和移植物抗宿主?。ㄝ斎氲募?xì)胞療法攻擊患者的健康組織）。
基因編輯提供了一種敲除供體T細(xì)胞的TCR和HLA的方法，而CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)因?yàn)槠潇`活性和高效的編輯能力，成為敲除TCR和HLA表達(dá)的有力工具。以往的臨床前實(shí)驗(yàn)顯示，利用表達(dá)嵌合抗原受體（CAR）的慢病毒載體可以遞送多個(gè)指導(dǎo)RNA（guide RNA），同時(shí)敲除內(nèi)源性TCR和HLA-1等多個(gè)蛋白的表達(dá)。
利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可以敲除內(nèi)源性TCR和HLA，生成“通用型”CAR-T細(xì)胞療法（圖片來(lái)源：參考資料[1]）
而且，使用CRISPR/Cas9技術(shù)還可以將表達(dá)CAR的序列特異性地插入到細(xì)胞的T細(xì)胞受體α恒定區(qū)（TRAC）的基因位點(diǎn)，帶來(lái)CAR的一致性表達(dá)。在體外和小鼠模型中，這種方法生成的CAR-T細(xì)胞與常規(guī)CAR-T細(xì)胞相比，表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗癌活性。
利用CRISPR基因編輯增強(qiáng)T細(xì)胞療法抗癌活性
困擾CAR-T療法療效持久性的另一個(gè)因素是T細(xì)胞耗竭和具有免疫抑制特征的腫瘤微環(huán)境。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種免疫檢查點(diǎn)蛋白能夠起到抑制T細(xì)胞活性或者促進(jìn)T細(xì)胞耗竭的效果，包括PD-1， CTLA-4，LAG-3和TIM-3等等。因此，CRISPR基因編輯系統(tǒng)已經(jīng)在臨床前研究中被用來(lái)敲除這些免疫檢查點(diǎn)蛋白，旨在增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞療法的抗癌活性和持久性。
在異種移植癌癥模型中，使用CRISPR基因編輯敲除PD-1表達(dá)，讓CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除PD-L1陽(yáng)性腫瘤的活性。
利用CRISPR基因編輯系統(tǒng)，可以敲除或敲低多種抑制CAR-T細(xì)胞療法活性的基因（圖片來(lái)源：參考資料[1]）
日前，由諾獎(jiǎng)得主Jennifer Doudna教授聯(lián)合創(chuàng)建的Caribou Biosciences公司宣布，該公司利用CRISPR基因編輯敲除PD-1表達(dá)的同種異體CAR-T療法，已經(jīng)在治療復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的1期臨床試驗(yàn)中完成首例患者給藥。
CRISPR在改造TCR-T細(xì)胞療法方面的應(yīng)用
雖然CAR-T療法在治療血液癌癥方面療效顯著，但是它們?cè)谥委煂?shí)體瘤方面尚未表現(xiàn)出類似的顯著效果，缺乏在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的特異性抗原靶點(diǎn)是限制CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤領(lǐng)域應(yīng)用的原因之一。而TCR-T細(xì)胞療法因?yàn)榭梢园邢蚰[瘤內(nèi)部表達(dá)的抗原，在治療實(shí)體瘤方面可能具有更好的前景。
TCR-T細(xì)胞療法的生成需要在T細(xì)胞上表達(dá)能夠與腫瘤細(xì)胞呈遞的抗原復(fù)合體結(jié)合的T細(xì)胞受體。阻礙TCR-T細(xì)胞療法的一個(gè)主要原因是T細(xì)胞內(nèi)源性TCR的表達(dá)。它們可能與轉(zhuǎn)基因TCR發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，阻礙轉(zhuǎn)基因TCR的表達(dá)和與CD3受體的結(jié)合。內(nèi)源性TCR還可能與轉(zhuǎn)基因TCR形成異二聚體，影響它們與抗原復(fù)合體的結(jié)合。
CRISPR基因編輯系統(tǒng)可以敲除內(nèi)源性TCRα和β基因，并且將它們替換成腫瘤特異性TCR序列。這種基因編輯與其它技術(shù)結(jié)合，能夠幾乎100%地消除異二聚體的產(chǎn)生，從而改善TCR-T細(xì)胞療法的抗癌活性。
CRISPR基因編輯系統(tǒng)可以敲除內(nèi)源性TCRα和β基因，消除異二聚體的產(chǎn)生（圖片來(lái)源：參考資料[1]）
賓夕法尼亞大學(xué)Abramson癌癥中心的Stadtmauer教授團(tuán)隊(duì)已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中證明，使用CRISPR技術(shù)可以成功敲除內(nèi)源性TCR，生成的靶向NY-ESO-1抗原的TCR-T細(xì)胞療法在３名患者中表現(xiàn)出良好的安全性。它們可以患者體內(nèi)擴(kuò)增，并表現(xiàn)出對(duì)腫瘤的靶向性。
改善腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞的抗癌活性
在治療實(shí)體瘤方面，腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞（TIL）療法已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出出色的療效。例如，Iovance Biotherapeutics開(kāi)發(fā)的TIL療法在治療晚期宮頸癌、黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌患者時(shí)都顯示出可喜的緩解率和緩解持續(xù)時(shí)間。這種療法從患者的腫瘤組織中分離腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞，在體外進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增，然后輸回到患者體內(nèi)。
然而，它遇到的潛在問(wèn)題是從腫瘤組織中獲得的TIL數(shù)目相對(duì)較少，需要在體外進(jìn)行大幅度擴(kuò)增。而大幅擴(kuò)增的過(guò)程可能讓TIL進(jìn)入分化狀態(tài)，當(dāng)它們?cè)俦惠敾氐交颊唧w內(nèi)后會(huì)更快地進(jìn)入耗竭狀態(tài)，導(dǎo)致療法效果降低。
而通過(guò)CRISPR基因編輯，可以敲除TIL細(xì)胞中的免疫檢查點(diǎn)蛋白，讓TIL在體外擴(kuò)增之后仍然保留分化程度較低的干細(xì)胞特征，從而延長(zhǎng)TIL細(xì)胞療法的持久性。
明尼蘇達(dá)大學(xué)（University of Minnesota）的研究人員已經(jīng)啟動(dòng)一項(xiàng)臨床試驗(yàn)，將使用CRISPR基因編輯系統(tǒng)敲除TIL細(xì)胞中的檢查點(diǎn)基因CISH，在胃腸道癌癥患者中檢驗(yàn)用這一方法擴(kuò)增的TIL細(xì)胞療法的效果。
發(fā)現(xiàn)更多增強(qiáng)細(xì)胞療法療效的基因
CRISPR基因編輯系統(tǒng)作為一種工具，能夠高特異性地編輯T細(xì)胞的基因組，這讓研發(fā)人員有機(jī)會(huì)對(duì)多個(gè)用藥物無(wú)法靶向的基因進(jìn)行改造，從而從不同角度增強(qiáng)細(xì)胞療法的抗癌活性。而且，CRISPR基因編輯系統(tǒng)的另一項(xiàng)應(yīng)用——CRISPR篩選，已經(jīng)被研發(fā)人員用來(lái)篩選能夠提高免疫療法療效的基因靶點(diǎn)。目前已經(jīng)有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了新的T細(xì)胞激活調(diào)節(jié)因子，T細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)因子，以及抗原處理/呈遞通路和干擾素通路中的創(chuàng)新靶點(diǎn)，為CRISPR基因編輯提供了更多的靶點(diǎn)。
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