近年來(lái)，過(guò)繼細(xì)胞免疫治療（adoptive cell transfer，ACT）取得了重大的發(fā)展，成為繼手術(shù)和放化療等常規(guī)腫瘤治療手段外新興的治療方法。嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）治療是ACT中具應(yīng)用前景的治療方法之一。
目前，靶向CD19的CAR-T在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤時(shí)療效顯著，而且已有兩款產(chǎn)品于2017年經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市2，3。然而，雖經(jīng)多番嘗試，靶向其他多種腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigens，TAA）的CAR-T對(duì)于實(shí)體瘤的治療效果卻仍欠佳4。
近日，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所王皓毅課題組在 JCI insight 雜志上發(fā)表題為：TGFβ inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR-T cells against solid tumors 的研究論文。
該研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)將CAR-T表面的TGFβ受體2（TGFBR2）基因進(jìn)行編輯，并在多種實(shí)體瘤模型小鼠中證實(shí)TGFBR2編輯的CAR-T在TGFβ富集的環(huán)境中具有更強(qiáng)更持久的腫瘤清除能力。
CAR-T細(xì)胞在浸潤(rùn)至實(shí)體腫瘤組織后所面臨的抑制性腫瘤微環(huán)境（TME）是CAR-T療法對(duì)于實(shí)體瘤的治療效果欠佳的主要的原因之一。實(shí)體瘤由高度異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種類(lèi)型細(xì)胞和大量的細(xì)胞外基質(zhì)組成。在這復(fù)雜的TME中，CAR-T的存活、增殖和活化等功能都被多種免疫抑制細(xì)胞和因子所影響5。
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ）是TME中重要的調(diào)控因子之一，其可由多種基質(zhì)細(xì)胞如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）、血管內(nèi)皮細(xì)胞（BECs）、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）等所分泌。TGFβ可通過(guò)多種直接或間接的機(jī)制負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能，從而降低機(jī)體的抗腫瘤免疫能力和腫瘤免疫監(jiān)視能力6，7。
基于此，王皓毅帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)將CAR-T表面的TGFβ受體2（TGFBR2）基因進(jìn)行編輯，阻斷TGFβ信號(hào)通路，然后在腫瘤細(xì)胞系成瘤（CDX）模型小鼠中瘤內(nèi)注射CAR-T細(xì)胞，觀察到注射后42天，TGFBR2編輯的CAR-T（M28z-TKO）即可將腫瘤清除，而未編輯的CAR-T（M28z）只能將腫瘤生長(zhǎng)控制在相對(duì)較慢的速度。通過(guò)對(duì)小鼠外周血進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)M28z-TKO之所以具有更強(qiáng)的腫瘤清除能力源于其有更好的增殖能力以及有更高比例的記憶細(xì)胞。
▲ 瘤內(nèi)注射CAR-T后腫瘤體積的監(jiān)測(cè)
考慮到無(wú)創(chuàng)性的靜脈輸注方式在臨床使用中更為普遍便捷，研究人員進(jìn)一步觀察了在相同的模型小鼠中靜脈注射M28z-TKO是否仍能將腫瘤有效清除。相對(duì)于瘤內(nèi)注射M28z-TKO能清除腫瘤，靜脈注射只能基本控制腫瘤的生長(zhǎng)。然而，相對(duì)于M28z注射后逐漸失控的腫瘤生長(zhǎng)，M28z-TKO在靜脈注射后能更有效地浸潤(rùn)至腫瘤組織，并在腫瘤組織中更好地增殖和發(fā)揮殺傷功能，這極有可能是其清瘤效果明顯改善的主要原因。
▲ TGFBR2敲除改善了靜脈注射的CAR-T在CDX模型小鼠體內(nèi)的腫瘤清除效果（A）瘤內(nèi)注射CAR-T后腫瘤體積的監(jiān)測(cè)；（B）CDX組織中CAR-T浸潤(rùn)情況檢測(cè)；（C）CDX組織中MKI67陽(yáng)性CAR-T檢測(cè)；（D）CDX組織中IFNG陽(yáng)性CAR-T檢測(cè)。i.v.，靜脈注射。
考慮到臨床腫瘤組織異質(zhì)性更高及病理類(lèi)型多樣，文章作者又在2例胰腺癌病人腫瘤標(biāo)本構(gòu)建的實(shí)體瘤（PDX）模型中進(jìn)一步驗(yàn)證了M28z-TKO的功能優(yōu)勢(shì)。
其中，PDX #1組織結(jié)構(gòu)疏松，靶向抗原間皮素表達(dá)豐度高且均一，TGFβ亦有明顯表達(dá)。無(wú)論是瘤內(nèi)或靜脈注射，M28z-TKO都能在注射后21天左右將腫瘤全部清除。注射后第42天，小鼠外周血分析可見(jiàn)人CD3陽(yáng)性細(xì)胞比例在M28z-TKO注射組亦明顯升高。
值得一提的是，在腫瘤全部清除的小鼠體內(nèi)進(jìn)行二次接種后，新接種的瘤體再次被全部清除，而且小鼠外周血中人CD3陽(yáng)性細(xì)胞絕大部分都是記憶性T細(xì)胞。
雖然PDX #2組織結(jié)構(gòu)致密且靶向抗原表達(dá)異質(zhì)性高，但是瘤內(nèi)注射M28z-TKO仍能將初次和二次接種的瘤體有效清除。這些體內(nèi)數(shù)據(jù)充分證實(shí)了TGFβ信號(hào)通路的阻斷能極大改善CAR-T清除實(shí)體瘤的能力。
此外，文章作者也對(duì)TGFBR2敲除CAR-T功能得以明顯改善的潛在機(jī)制做了詳細(xì)探討。RNAseq數(shù)據(jù)顯示在CAR-T與腫瘤細(xì)胞共孵育體系中外源添加TGFβ1，CAR-T的細(xì)胞毒性相關(guān)基因如GZMA、GZMB，細(xì)胞因子相關(guān)基因如IFNG、IL2，以及細(xì)胞增殖相關(guān)基因如IL2RA的表達(dá)水平明顯下調(diào)；而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）相關(guān)基因如FOXP3，以及耗竭相關(guān)基因如PDCD1的表達(dá)明顯上調(diào)；TGFBR2敲除則使CAR-T免受TGFβ1的影響。
▲ 利用CRISPR技術(shù)阻斷TGFβ信號(hào)通路使得CAR-T清除實(shí)體瘤能力極大改善的可能機(jī)制
進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)也證明TGFβ可通過(guò)如上所述機(jī)制調(diào)節(jié)CAR-T功能，而利用CRISPR技術(shù)將該通路阻斷可極大改善CAR-T的體內(nèi)外功能。
總的看來(lái)，此篇文章利用CRISPR技術(shù)將CAR-T的內(nèi)源性TGFBR2進(jìn)行編輯，極大改善了其在TGFβ富集環(huán)境中的功能。這一方法為增強(qiáng)CAR-T實(shí)體瘤清除能力提供了新的策略，也為眾多的實(shí)體瘤患者帶來(lái)了新的希望。
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