自CAR-T療法在2017年首次獲批以來，這一突破性療法的臨床前和臨床期開發(fā)出現(xiàn)了爆發(fā)式的增長。去年，楊森（Janssen）/南京傳奇、百時(shí)美施貴寶（BMS）、吉利德科學(xué)/Kite Pharma、和諸多中國生物醫(yī)藥公司開發(fā)的CAR-T療法亮出令人驚艷的數(shù)據(jù)。今年，更可能有2款以上CAR-T療法獲得FDA批準(zhǔn)上市，將獲批療法的數(shù)目翻倍。
然而，獲批的CAR-T療法雖然在治療血液癌癥時(shí)展現(xiàn)出優(yōu)異和持久的療效，但是它的推廣卻面臨著多種挑戰(zhàn)。目前獲批上市的CAR-T療法為自體（autologous）CAR-T療法，這意味著醫(yī)生需要從患者體內(nèi)獲取T細(xì)胞，在體外通過基因工程在T細(xì)胞表面表達(dá)針對(duì)癌癥抗原的嵌合抗原受體（CAR），然后將增殖后的細(xì)胞輸回患者體內(nèi)。這一繁瑣的生產(chǎn)過程可能耗時(shí)長達(dá)3周，而且成本不菲。有些患者因?yàn)樯眢w健康水平，前期治療等多種原因，無法提供足夠的T細(xì)胞，導(dǎo)致他們不能從這一突破性技術(shù)中獲益。
從健康供體中獲得細(xì)胞制造同種異體（allogeneic）CAR-T細(xì)胞有潛力解決自體CAR-T細(xì)胞面對(duì)的這些挑戰(zhàn)。新年伊始，Nature Reviews Drug Discovery上發(fā)表的一篇綜述對(duì)“即用型”同種異體CAR-T療法的開發(fā)現(xiàn)狀進(jìn)行了深度盤點(diǎn)。
同種異體CAR-T細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)和挑戰(zhàn)
同種異體CAR-T細(xì)胞的制造流程起始于從健康供體中獲得的T細(xì)胞或者其它細(xì)胞類型，這些細(xì)胞在經(jīng)過基因工程改造，在細(xì)胞表面表達(dá)能夠靶向癌細(xì)胞的CAR之后，接受進(jìn)一步基因編輯降低異體CAR-T細(xì)胞攻擊宿主的風(fēng)險(xiǎn)和宿主細(xì)胞排斥異體CAR-T細(xì)胞的可能。然后這些細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)、增殖、提純、分裝成可以隨時(shí)使用的產(chǎn)品冷凍保存。
▲自體CAR-T和同種異體CAR-T療法的制造流程（圖片來源：Allogene公司官網(wǎng)）
這種CAR-T療法的優(yōu)勢(shì)在于：
從單一健康供體提供的細(xì)胞可以生成大量CAR-T細(xì)胞，滿足大量患者的需求。例如，致力于開發(fā)同種異體CAR-T細(xì)胞的Allogene公司表示，從一名健康供體中獲得的細(xì)胞可以制成治療100名癌癥患者的CAR-T療法。
這些細(xì)胞已經(jīng)生成并且冰凍在庫存中，需要接受治療的患者只需要解凍庫存的療法就可以立即接受治療，消除了自體CAR-T療法制造過程中產(chǎn)生的延遲。
而且，通常癌癥患者由于自身T細(xì)胞數(shù)目的限制，導(dǎo)致他們無法接受多次CAR-T療法的治療。而同種異體CAR-T療法可以更容易重復(fù)對(duì)患者進(jìn)行治療，并且改變CAR-T療法靶向的抗原，克服對(duì)CAR-T療法的抗性。
然而，同種異體CAR-T療法的開發(fā)也需要面對(duì)獨(dú)特的兩大挑戰(zhàn)：一，輸入患者的異體細(xì)胞可能對(duì)宿主進(jìn)行攻擊，導(dǎo)致危及患者生命的移植物抗宿主?。℅VHD）；二，異體細(xì)胞可能迅速被宿主的免疫細(xì)胞識(shí)別并消滅，限制它們的抗腫瘤活性。
解決移植物抗宿主病的策略
同種異體CAR-T細(xì)胞攻擊宿主組織的原因是因?yàn)檫@些T細(xì)胞表面表達(dá)的T細(xì)胞受體（TCR）能夠識(shí)別宿主組織上的異體抗原，從而引發(fā)T細(xì)胞對(duì)宿主組織的攻擊。目前，克服移植物抗宿主病的策略主要分為兩類，一類使用基因編輯方法消除T細(xì)胞上的天然TCR表達(dá)，另一類使用其它不會(huì)導(dǎo)致GVHD的細(xì)胞類型。
基因編輯方法消除T細(xì)胞的天然TCR表達(dá)
由于常用的αβ型T細(xì)胞表面天然表達(dá)的TCR是介導(dǎo)這些T細(xì)胞攻擊宿主的關(guān)鍵。研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種方法，防止TCR在這些細(xì)胞表面的表達(dá)。其中進(jìn)展快的方法是使用基因編輯技術(shù)。αβ型T細(xì)胞表面的TCR蛋白復(fù)合體由α鏈和β鏈構(gòu)成，只有一個(gè)基因編碼α鏈的恒定區(qū)（constant regions）。因此，破壞編碼T細(xì)胞受體α鏈恒定區(qū)（TRAC）的基因是阻止αβ型TCR表達(dá)直接有效的方法。利用這一策略產(chǎn)生的同種異體CAR-T療法已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。
這一策略的優(yōu)勢(shì)在于，可以使用健康供體中大量的αβ型T細(xì)胞作為原材料制造CAR-T細(xì)胞。目前有多種基因編輯技術(shù)可以用于特異性破壞編碼TRAC的基因，它們包括鋅指核酸酶（ZFN），轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN），MegaTAL，和CRISPR基因編輯系統(tǒng)。在研究中，研究人員利用細(xì)胞的同源重組機(jī)制，將表達(dá)CAR的轉(zhuǎn)基因直接導(dǎo)入TRAC基因的位點(diǎn)。這一策略具有“一石二鳥”的效果，在破壞T細(xì)胞的天然TCR表達(dá)的同時(shí)，讓CAR轉(zhuǎn)基因在TRAC基因的位點(diǎn)表達(dá)，接受天然TCR基因啟動(dòng)子的調(diào)控。動(dòng)物試驗(yàn)表明，這種策略產(chǎn)生的靶向CD19的CAR-T療法比隨機(jī)插入CAR轉(zhuǎn)基因生成的CAR-T療法具有更好的抗癌活性。
使用基因編輯策略的一個(gè)隱患是基因編輯技術(shù)的脫靶效應(yīng)可能產(chǎn)生潛在風(fēng)險(xiǎn)。然而，由于異體細(xì)胞都會(huì)被宿主消滅，這一潛在風(fēng)險(xiǎn)的影響可能相對(duì)較低。
使用降低GVHD風(fēng)險(xiǎn)的細(xì)胞類型
降低異體CAR-T細(xì)胞攻擊宿主風(fēng)險(xiǎn)的另一個(gè)策略是使用不會(huì)產(chǎn)生GVHD或產(chǎn)生GVHD風(fēng)險(xiǎn)較低的細(xì)胞類型。它們包括天然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），γδ型T細(xì)胞，NK T細(xì)胞（表達(dá)NK細(xì)胞表面標(biāo)志物的T細(xì)胞），病毒特異性記憶T細(xì)胞。
提高同種異體CAR-T細(xì)胞持久性的策略
雖然上述的多種方法可以降低輸入到患者體內(nèi)的異體CAR-T攻擊宿主的風(fēng)險(xiǎn)，但是同種異體CAR-T療法還需要解決另一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，那就是患者的免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別這些細(xì)胞是“外來”細(xì)胞，從而對(duì)它們產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。這種免疫排斥會(huì)將輸入患者體內(nèi)的異體CAR-T細(xì)胞完全消滅。而由患者自身T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能在異體CAR-T療法輸入時(shí)就馬上開始工作，降低異體CAR-T療法的療效。因此，如何提高同種異體CAR-T療法的持久性是這一領(lǐng)域急需解決的問題。目前解決這一問題的研究沿著下面的幾個(gè)方向進(jìn)行：
更為有效的淋巴細(xì)胞清除手段
已有的研究已經(jīng)表明，想讓輸入的CAR-T細(xì)胞在患者體內(nèi)增殖，需要在輸入細(xì)胞之前先使用化療等手段清除患者體內(nèi)已有的淋巴細(xì)胞，從而為輸入的CAR-T細(xì)胞提供增殖的空間。對(duì)于同種異體CAR-T細(xì)胞來說，清除淋巴細(xì)胞這一步可能更為重要，因?yàn)闅埓娴乃拗鱐細(xì)胞會(huì)立刻攻擊“外來”的CAR-T細(xì)胞。
目前一種在研方法是通過基因編輯讓同種異體的CAR-T細(xì)胞對(duì)清除T細(xì)胞的藥物產(chǎn)生抗性，這些細(xì)胞就不會(huì)受到清除T細(xì)胞藥物的影響。例如，Allogene公司開發(fā)的UCART19使用基因編輯手段，敲除了細(xì)胞表達(dá)CD52蛋白的基因。這讓這些細(xì)胞對(duì)通過與CD52相結(jié)合，殺死T細(xì)胞的單克隆抗體alemtuzumab產(chǎn)生抗性。將alemtuzumab與化療聯(lián)用可以更有效地清除宿主的成熟T細(xì)胞，并且將宿主的成熟T細(xì)胞維持在低水平。與此同時(shí)，同種異體的CAR-T療法仍然可以發(fā)揮作用。
▲通過抑制CAR-T細(xì)胞中CD52蛋白的表達(dá)提高CAR-T持久性的策略（圖片來源：Allogene官網(wǎng)）
基因編輯還可以讓同種異體的CAR-T細(xì)胞對(duì)清除T細(xì)胞的化療藥物產(chǎn)生抗性，從而讓它們?cè)谝种芓細(xì)胞生長的環(huán)境中正常工作。然而，這一策略的弊端在于患者體內(nèi)的內(nèi)源T細(xì)胞水平會(huì)被壓制到很低的水平，導(dǎo)致他們感染的風(fēng)險(xiǎn)顯著提高。
降低同種異體CAR-T細(xì)胞的免疫原性
器官移植和造血干細(xì)胞移植的經(jīng)驗(yàn)表明，如果供體的主要人類白細(xì)胞抗原（HLA）表型與宿主的HLA表型相似，就可以大幅度減少對(duì)移植物的免疫排斥。基于這一經(jīng)驗(yàn)，理論上可以通過發(fā)現(xiàn)具有特定HLA表型的供體，構(gòu)建供體細(xì)胞庫，從中選擇與患者匹配的供體細(xì)胞生成同種異體CAR-T細(xì)胞。
由于1類HLA蛋白是介導(dǎo)免疫排斥因素的關(guān)鍵分子。另一種策略是使用基因工程手段，消除同種異體CAR-T細(xì)胞表面表達(dá)的1類HLA蛋白。HLA在細(xì)胞表面的表達(dá)需要名為β2-microglobulin的亞基，通過基因工程敲除β2-microglobulin的表達(dá)就可以防止HLA蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)，從而降低這些細(xì)胞的免疫原性。
▲HLA結(jié)構(gòu)（圖片來源：User atropos235 on en.wikipedia [CC BY-SA (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)]）
選擇較好的T細(xì)胞亞群
T細(xì)胞群體包含多種具有不同功能和表型的T細(xì)胞亞群。而不同T細(xì)胞亞群在攻擊癌細(xì)胞的能力和在患者體內(nèi)的持久性等方面表現(xiàn)也大不相同。例如，臨床前研究表明，由CD8陽性和CD4陽性幼稚T細(xì)胞（na?ve T cell，TN）和中央記憶細(xì)胞（central memory T cells，TCM）生成的CAR-T細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的殺傷能力更強(qiáng)。
而使用自體CAR-T療法治療慢性淋巴細(xì)胞白血病的臨床研究表明，TCM和具有自我復(fù)制能力的干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞（stem-like memory T cell, TSCM）的質(zhì)量，以及細(xì)胞耗竭生物標(biāo)志物的表達(dá)水平（包括PD-1， TIM3，LAG3等），是CAR-T療法活性和持久性的重要指標(biāo)。
因此，通過改進(jìn)篩選和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可以富集特定的T細(xì)胞亞群，從而改善療法的持久性。在這一方面，從健康供體中獲得的T細(xì)胞可能具有潛在的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗麄儧]有接受過可能影響T細(xì)胞群體的前期療法的治療，因此可以提供包含豐富TN，TCM，和TSCM的T細(xì)胞。
同種異體CAR-T療法的臨床進(jìn)展
目前，多項(xiàng)在研同種異體CAR-T療法已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，治療急性淋巴細(xì)胞白血病和急性髓系白血病（ALL）患者等血液癌癥和實(shí)體瘤（見下表）。
2018年，Allogene公司開發(fā)的UCART19的初步臨床結(jié)果表明，在治療復(fù)發(fā)難治型ALL患者時(shí)，UCART19達(dá)到82%的完全緩解/血液學(xué)不完全恢復(fù)的完全緩解（CR/CRi）。由于UCART19在患者體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間有限，接受UCART19的兒科患者隨后接受了造血干細(xì)胞移植療法。
CAR-T和細(xì)胞療法的未來
關(guān)于“即用型”CAR-T療法，業(yè)內(nèi)也有著兩派不同的觀點(diǎn)。許多人相信，它能解決CAR-T療法難以制備，生產(chǎn)周期長的痛點(diǎn)，為全球更多病患帶來治療的新希望；但也有一些專家相信，“即用型”CAR-T療法只是一時(shí)的“權(quán)宜之計(jì)”。歸根結(jié)底，是我們對(duì)“自體型”CAR-T療法的洞見還不夠深刻。
近來，藥明康德內(nèi)容團(tuán)隊(duì)與多名細(xì)胞療法領(lǐng)域的權(quán)威專家進(jìn)行了對(duì)話。其中，Lyell Immunopharma的創(chuàng)始人兼執(zhí)行官Rick Klausner博士展望了細(xì)胞療法的未來。這名美國國家癌癥中心（NCI）的前負(fù)責(zé)人指出，目前研發(fā)“即用型”CAR-T療法的動(dòng)力之一，在于當(dāng)下制造“自體型”CAR-T療法的種種瓶頸。然而我們需要認(rèn)識(shí)到，當(dāng)下制造CAR-T療法的技術(shù)遠(yuǎn)未臻成熟。5-10年后，細(xì)胞療法的研發(fā)與生產(chǎn)制造勢(shì)必將與現(xiàn)在大不一樣。
Klausner博士提到，目前的細(xì)胞療法生產(chǎn)之所以耗時(shí)費(fèi)力，在于我們并不知道其中的哪些細(xì)胞真正具有治療的效力。因此我們只能不斷擴(kuò)增T細(xì)胞，希望在天文數(shù)字的細(xì)胞中，具有療效的細(xì)胞數(shù)能夠達(dá)標(biāo)。而在未來，如果我們能分離出那些具有療效的細(xì)胞亞群，就能大幅降低治療癌癥所需的細(xì)胞數(shù)目。這能極大地減少我們所需培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量，并把細(xì)胞療法的生產(chǎn)時(shí)間從數(shù)周縮短到短短幾天。
這聽起來像是天方夜譚，卻代表了未來的一個(gè)前進(jìn)方向。要知道，在一臺(tái)計(jì)算器要占去一整間房屋的時(shí)代，也沒有多少人能預(yù)想到智能手機(jī)的出現(xiàn)。而兩者之間，相隔只有數(shù)十年。
MD安德森癌癥中心的癌癥醫(yī)學(xué)部主任Patrick Hwu博士則指出了不同的應(yīng)用前景。對(duì)于某些比較敏感的癌癥來說，“即用型”的CAR-T療法在短期內(nèi)就能起到很好的效果，因此不必過于擔(dān)心它被免疫系統(tǒng)所排斥的問題。而對(duì)于實(shí)體瘤，我們希望T細(xì)胞在腫瘤附近停留盡量久的時(shí)間，“自體型”的CAR-T療法則會(huì)有更大的發(fā)揮空間。
而我們要知道，關(guān)于“即用型”和“自體型”CAR-T療法的熱議，只是細(xì)胞療法的冰山一角。是的，自獲批以來，CAR-T療法領(lǐng)域吸引了大量的目光和關(guān)注。但兩位專家指出，細(xì)胞療法，并不是只有CAR-T療法一種。T細(xì)胞療法以外的細(xì)胞療法，同樣是未來的發(fā)展方向。而基因與細(xì)胞療法有望在生物技術(shù)的浪潮之下，為全球病患帶來新的突破。
參考資料：
[1] Depil et al., (2020). ‘Off- the-shelf’ allogeneic CAR T cells: development and challenges. Nature Reviews Drug Discovery, https://doi.org/10.1038/s41573-019-0051-2
[2] Allogen Corporate Presentation. Retrieved January 5, 2020, from https://ir.allogene.com/static-files/f44b1f83-83eb-4cd0-b0fa-4f327b17fefb
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