科學家利用iPSC培養(yǎng)出高度成熟神經(jīng)元，有望治療帕金森/阿爾茲海默癥等
自 2006 年山中伸彌等發(fā)現(xiàn)了將體細胞誘導為多能干細胞的奧秘后，越來越多研究者的目光聚集到了這一領域。人們相信誘導多能干細胞（iPSC）可被用于廣泛的體外研究，甚至用于更加精準的定制化細胞療法中。不過，盡管研究人員已經(jīng)可以分化干細胞成為神經(jīng)元，但這些神經(jīng)元在功能上還是不成熟的，這極大的影響了iPSC衍生神經(jīng)元的應用和研究潛力。
2023 年 1 月 12 日，西北大學的研究者們在體外條件下由 iPSC 創(chuàng)造出了高度成熟的人類神經(jīng)元，這項工作將為神經(jīng)退行性疾病以及創(chuàng)傷治療領域的研究開辟新的機會。
Samuel I. Stupp 博士與 Evangelos Kiskinis 博士團隊利用超分子納米纖維（supramolecular nanofiber）生成適用于神經(jīng)元的細胞外環(huán)境（ECM），誘導了細胞的分化以及功能形成。該項研究以 Artificial extracellular matrix scaffolds of mobile molecules enhance maturation of human stem cell-derived neurons 為題，在 Cell Stem Cell 期刊上線上發(fā)布。[1]
超分子納米纖維——新型 ECM
利用 iPSC 模型研究人類神經(jīng)系統(tǒng)相對體內(nèi)研究有著諸多優(yōu)勢。然而其重大的限制之一是無法有效模擬成熟神經(jīng)元的功能。文章通訊作者 Stupp 博士說：“將 iPSC 誘導成為神經(jīng)元，我們得到的是初生神經(jīng)元。但想要在疾病治療的研究中發(fā)揮作用，我們需要成熟的神經(jīng)元。否則就如同讓一個孩子去干成人才能完成的活兒了?！盵2]
為了突破這一難題，研究團隊試圖從神經(jīng)元的 ECM 入手。經(jīng)過長期的研究，人們普遍認為 ECM 對于細胞功能的維持、細胞分裂、自體更新以及干細胞分化等都起著重要的作用。[3] 針對 iPSC 誘導神經(jīng)元的研究，當前的可及的 ECM 方案主要采用了二維平面上包被 laminin的方式，而 laminin 是體內(nèi)神經(jīng)元 ECM 的主要成分之一并在成熟的脊髓的細胞中高表達。然而，在類似的二維環(huán)境中，神經(jīng)元常常產(chǎn)生大量聚集，這不僅使得利用高分辨率顯微鏡進行觀察極其不便，也不可避免地阻礙了神經(jīng)元的成熟，以及后續(xù)的相關研究。于是，研究團隊創(chuàng)造性地利用超分子納米纖維生成了神經(jīng)元 ECM。
該種超分子納米纖維由肽兩親分子（peptide amphiphiles，PA）自組裝形成，暴露在表面的是源于 laminin α-1 的肽段（異亮氨酸-亮氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸）。研究團隊針對性地對中間的鏈接部分進行了優(yōu)化改造，從而創(chuàng)造出了三種具有不同移動性的超分子納米纖維 PA1、PA2 與 PA3。團隊首先利用冷凍透射電鏡與掃描電鏡（cyro-TEM 與 SEM）驗證了肽兩親分子的成功自組裝，接著用窄角 X 光散射（SAXS）、廣角 X 光散射 （WAXS）、原子力顯微鏡（AFM）、弛豫核磁共振光譜（T2-NMR）等驗證了超分子納米纖維的結構，并展示了 PA2 相對于 PA1 與 PA3 的高流動性、高移動性與高水合性。
超分子納米纖維支持神經(jīng)元成熟化
團隊將由人類 iPSC 誘導的運動神經(jīng)元生長在由 PA1、PA2、PA3 超分子納米纖維形成的 ECM 或者商業(yè)化的 laminin ECM 上，均觀察到有效的細胞貼附。納米纖維培養(yǎng)的細胞β1-integrin（ITGB1）高表達，且在納米纖維上的細胞貼附依賴于 ITGB1。
接著，團隊將細胞培養(yǎng)的時間延長到 60 天，驚奇地發(fā)現(xiàn)在納米纖維上細胞生長良好，而 laminin 上的細胞層厚度大大減小。通過蛋白質(zhì)譜以及基因聚類分析，團隊識別到多個重要通路，包括“細胞-基質(zhì)貼附”、“肌絲-微觀組織”、“細胞運動調(diào)控”以及“細胞凋亡”等通路在納米纖維上的運動神經(jīng)元中得到調(diào)控。而這些通路中的大多數(shù)都已在之前的研究中被確定可以被 intergrin 調(diào)控。細胞層面上，納米纖維培養(yǎng)的細胞存活率較 laminin 更高。而其中 PA2 培養(yǎng)的細胞，則有更大的神經(jīng)元胞體，更長、更復雜的分支形成以及更廣泛均勻的細胞分布。
神經(jīng)元功能性上，團隊展示了 PA2 培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞相較 PA1、PA3 和 laminin 培養(yǎng)的細胞有更高的突觸前和突觸后相關蛋白表達。利用單細胞膜片鉗，團隊發(fā)現(xiàn) PA2 培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生更強更密集的電位；多電極陣列也顯示了類似的結果。這些均說明 PA2 培養(yǎng)的細胞更加成熟，功能也更完備。
超分子納米纖維支持
神經(jīng)退行性疾病的新型體外模型構建
為了探索利用該納米纖維研究神經(jīng)退行性疾病的可能性，團隊選取了肌萎縮側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）作為模型。團隊將一種被廣泛運用的 ALS 細胞模型，SOD1+/4AV 培養(yǎng)在 PA2 上。團隊發(fā)現(xiàn)與 laminin 培養(yǎng)相比，PA2 培養(yǎng)的突變細胞表現(xiàn)出更多的 SOD1 與 ubiquitin 蛋白聚集，而這正是 ALS 發(fā)病的組織學特征之一。
文章另一位通訊作者 Kiskinis 博士指出：“這是我們能夠在 iPSC 誘導的體外實驗中看到成人 ALS 神經(jīng)元的錯誤蛋白聚集，這是一項突破。雖然我們目前還不知道出現(xiàn)這一癥狀的原因，但我們期待在未來可以更好地解釋該疾病?！盵2]
本研究突出展現(xiàn)了利用具備高流動性的超分子納米纖維構建 ECM，使得 ECM 與神經(jīng)元的接觸更加動態(tài)化的新型體外培養(yǎng)方式。這可以更好地維持神經(jīng)元功能，促進神經(jīng)元成熟。以該培養(yǎng)方式為基礎的體外模型，可以用于包括肌萎縮側索硬化癥、阿爾茲海默癥、帕金森病在內(nèi)的各項神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。更進一步地，提取病人的細胞進行重編程，以生成正常的細胞用于治療各項疾病也將成為可能。
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