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  外泌體表達(dá)蛋白在阿爾茨海默病診斷中的應(yīng)用
  
  2020-02-23 來源：中華內(nèi)科雜志
  
  
  
  阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是導(dǎo)致老年人癡呆的常見病因，隨著社會(huì)人口的老齡化，已成為全球重要的健康問題之一。目前我國65歲以上老年人中AD的患病率為3.21%[1]，約近600萬患者，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的照顧負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。AD是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前普遍認(rèn)可的特征性病理改變是在神經(jīng)細(xì)胞外的β淀粉樣蛋白（amyloid β，Aβ）聚集形成的老年斑和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)過度磷酸化的tau蛋白聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。通過檢測(cè)腦脊液中Aβ和tau的表達(dá)水平或正電子發(fā)射斷層成像（positron emission tomography，PET）上Aβ在大腦的沉積，很大程度地提高了AD診斷的準(zhǔn)確性，并被納入診斷標(biāo)準(zhǔn)和研究框架。然而，由于腰椎穿刺的有創(chuàng)性和PET對(duì)設(shè)備要求高、價(jià)格昂貴等局限性，限制了其在臨床工作中的廣泛開展。隨著對(duì)AD發(fā)病機(jī)制了解的不斷深入和檢測(cè)技術(shù)的革新，已從外周體液中發(fā)現(xiàn)了一些可能與AD發(fā)病相關(guān)的生物標(biāo)志物，而其臨床實(shí)踐的突破有賴于探尋能直接反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理生理改變的分子途徑。
  
  外泌體是直徑小于150 nm的囊泡樣結(jié)構(gòu)，20世紀(jì)70年代由Johnstone和Stahl首次描述，早期被認(rèn)為是細(xì)胞的"排泄物"，并沒有引起重視。直到近來幾年，人們發(fā)現(xiàn)這種微小膜泡中含有細(xì)胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸，能作為載體傳遞給其他細(xì)胞，從而改變受體細(xì)胞的功能，才開始逐漸受到關(guān)注。這些細(xì)胞特異性的蛋白和核酸，很可能反映出疾病的發(fā)病機(jī)制和病理生理過程中細(xì)胞內(nèi)變化的核心因素。由于外泌體可以穿過血腦屏障，外周循環(huán)中神經(jīng)系統(tǒng)來源的外泌體（neuronal derived-exosomes，NDEs）表達(dá)相關(guān)蛋白有可能成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在生物標(biāo)志物。
  
  外泌體在AD發(fā)病機(jī)制中的作用
  
  外泌體作為致病蛋白的運(yùn)送者，參與多種突變或錯(cuò)誤折疊的"毒性"蛋白的傳播。這種現(xiàn)象已在包括AD、帕金森病、朊蛋白病、多發(fā)性硬化、腦腫瘤和精神分裂癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病和精神疾病的研究中得到證實(shí)。外泌體參與AD病理過程于2002年被首次報(bào)道，之后的大量研究證實(shí)其在AD的發(fā)病機(jī)制中具有多重作用。
  
  淀粉樣蛋白前體（amyloid precursor，APP）被β位點(diǎn)APP切割酶1切割，主要發(fā)生在早期核內(nèi)體，之后產(chǎn)生的Aβ和其他的蛋白切割產(chǎn)物一起被轉(zhuǎn)運(yùn)到MVBs，進(jìn)而進(jìn)入外泌體中。研究表明，app和Aβ在MVBs中都有聚集，并且通過外泌體釋放到細(xì)胞外。對(duì)獼猴大腦切片的研究發(fā)現(xiàn)，AD病理改變?cè)缙趦?nèi)吞作用受損，誘導(dǎo)早期核內(nèi)體中神經(jīng)節(jié)苷脂（gangliosides，GM1）與Aβ緊密結(jié)合，進(jìn)一步引起淀粉樣纖維的形成。散發(fā)型AD患者的大腦中也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元內(nèi)吞途徑的損傷，例如早期核內(nèi)體的增大和核內(nèi)體中對(duì)于物質(zhì)運(yùn)輸起重要作用的Rab5蛋白的上調(diào)，這些損傷顯著加速了GM1相關(guān)外泌體的釋放，并誘導(dǎo)了淀粉樣纖維的形成。此外，研究發(fā)現(xiàn)Aβ多肽可以激活中性鞘磷脂酶2，誘導(dǎo)與Aβ接觸的星形膠質(zhì)細(xì)胞中前列腺細(xì)胞凋亡因子-4和神經(jīng)酰胺分泌增多，富含兩種促凋亡因子的外泌體分泌也增多，這些外泌體可以被未接觸Aβ多肽的星形膠質(zhì)細(xì)胞捕獲進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。而通過抑制外泌體的分泌，可以觀察到AD小鼠模型大腦中淀粉樣斑塊較前減少。
  
  外泌體也可以介導(dǎo)tau蛋白的擴(kuò)散和傳播，病理性tau蛋白的攝取導(dǎo)致受體細(xì)胞中單個(gè)tau蛋白的錯(cuò)誤折疊和聚集。對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤M1C細(xì)胞誘導(dǎo)的tau病理模型的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可以介導(dǎo)tau蛋白的輸出。在tau病理小鼠模型中觀察到外泌體參與了tau蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，通過耗竭小膠質(zhì)細(xì)胞或抑制其外泌體合成的方式均可減少tau蛋白的傳播。
  
  也有研究發(fā)現(xiàn)外泌體在AD的病理過程中起到保護(hù)作用。例如，富含鞘糖脂的神經(jīng)源性外泌體可以攝取Aβ，同時(shí)促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞捕獲Aβ，進(jìn)而減少了app轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中的Aβ沉積。另外，外泌體中高表達(dá)的細(xì)胞朊蛋白可以通過N端與Aβ高親和力結(jié)合，加速其纖維化，進(jìn)而減少了Aβ寡聚體的神經(jīng)毒性作用。由此可見，外泌體密切參與了AD的病理生理過程，然而在不同的發(fā)病時(shí)期可能對(duì)AD病理發(fā)揮著不同的，甚至是相反的作用。
  
  神經(jīng)源性外泌體表達(dá)蛋白對(duì)AD的診斷價(jià)值
  
  Goetzl和Kapogiannis團(tuán)隊(duì)首先利用化學(xué)吸附的方法提取血漿中總的外泌體，再使用抗人神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）抗體或者抗人CD171 [L1細(xì)胞黏附分子（L1 cell adhesion molecule，L1CAM）]抗體，利用免疫沉淀的方法進(jìn)一步提取NDEs，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)了NDEs的AD相關(guān)蛋白水平。初的研究主要集中在Aβ和tau蛋白，其中Aβ42、P-T181-tau和P-S396-tau水平在AD患者均高于正常對(duì)照。縱向研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)指標(biāo)在AD的臨床前期和前驅(qū)期已明顯升高，而總tau的表達(dá)并無顯著差異。隨后，通過此方法又陸續(xù)檢測(cè)了一些可能參與AD病理過程的蛋白在NDEs中的表達(dá)，例如：（1）突觸病理相關(guān)：突觸結(jié)合蛋白、突觸足蛋白、突觸小泡蛋白、神經(jīng)顆粒素（neurogranin，NRGN）等；（2）糖代謝減低/胰島素抵抗相關(guān)：異常磷酸化胰島素受體底物1（P-S312-IRS-1和P-panY-IRS-1）；（3）神經(jīng)退行性變相關(guān)及其他生物標(biāo)志物：溶酶體蛋白[Cathepsin D、溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein 1，LAMP1）等][30]和抑制元素1-沉默轉(zhuǎn)錄因子（repressor element 1 silencing transcription factor，REST）[26，31]。在上述已檢測(cè)的相關(guān)蛋白中，P-S312-IRS-1、P-panY-IRS-1、Cathepsin D、LAMP1、Ubiquitin、LRP6、HSP1、REST、HSP70、NRGN、突觸結(jié)合蛋白、突觸足蛋白、突觸小泡蛋白和突觸蛋白1等在AD患者和正常對(duì)照有明顯差異，其中大部分相關(guān)蛋白在癡呆癥狀出現(xiàn)前就已存在改變。此外，突觸病理相關(guān)蛋白與AD患者的認(rèn)知功能和病情嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。我國新近的多中心研究進(jìn)一步證實(shí)外周血NDEs與腦脊液的Aβ42、T-tau和P-T181-tau表達(dá)水平具有高度相關(guān)性。
  
  縱觀目前對(duì)外周NDEs表達(dá)蛋白檢測(cè)的研究，尚存在一些方法和技術(shù)上的問題待解決。首先，在外泌體的研究中，不可避免地會(huì)存在來自其他細(xì)胞外囊泡亞群的干擾。之前的研究大多應(yīng)用免疫沉淀的方法（如L1CAM抗體）提取NDEs，但嚴(yán)格講L1CAM并不是中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異的，在其他組織（例如脂肪和骨骼?。┮灿斜磉_(dá)[33]。另外，生物流體中還存在包括蛋白復(fù)合物、脂蛋白（高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和乳糜微滴）和微生物等可能對(duì)實(shí)驗(yàn)過程構(gòu)成影響的干擾物。其次，目前對(duì)生物標(biāo)志物的計(jì)數(shù)是比較粗略的，大多先要通過CD81的表達(dá)水平將NDEs含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。但CD81并不是外泌體相對(duì)特異的標(biāo)志物，其他的細(xì)胞囊泡結(jié)構(gòu)也有表達(dá)。Alix可能在外泌體計(jì)數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)化方面是一個(gè)重復(fù)性較好的標(biāo)志物[35]。此外，樣本采集和保存過程中的諸多因素，也可能對(duì)外泌體的提取和檢測(cè)構(gòu)成未知的影響。制定標(biāo)準(zhǔn)化的外泌體提取和分析操作流程，將是今后外泌體作為AD等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病生物標(biāo)志物應(yīng)用研究的重要環(huán)節(jié)。
  
  目前的研究表明外泌體在AD的發(fā)病中有多重作用。一方面，外泌體可在細(xì)胞間傳播毒性的Aβ和tau，并可能會(huì)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡；另一方面，由于小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)外泌體的攝取，可以減少大腦Aβ的負(fù)荷和毒性作用。盡管外泌體在AD病理生理過程中的具體作用還需要深入探索，但前期的初步研究已發(fā)現(xiàn)通過對(duì)外泌體表達(dá)分子的檢測(cè)可以有效早期識(shí)別AD，并預(yù)測(cè)輕度認(rèn)知障礙向AD的轉(zhuǎn)化。未來，通過對(duì)檢測(cè)技術(shù)的精準(zhǔn)化和標(biāo)準(zhǔn)化，開展與病理改變或腦脊液、PET等"金標(biāo)準(zhǔn)"的生物標(biāo)志物比較的前瞻性研究，將進(jìn)一步推進(jìn)外周外泌體檢測(cè)在AD早期診斷和病情監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。
  
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