近來在中國爆發(fā)的新型冠狀病毒（2019-nCoV）感染疫情如今已經(jīng)被列為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，這種病毒會引起發(fā)燒、嚴重呼吸道疾病和肺炎癥狀；冠狀病毒的S糖蛋白（spike glycoprotein）是開發(fā)新型疫苗、治療性抗體和診斷技術(shù)的關(guān)鍵靶點。2月19日，刊登在Science雜志上一篇題為“Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation”的研究論文中，來自美國德克薩斯大學和國家過敏和傳染病研究所的研究人員通過聯(lián)合研究利用冷凍電鏡技術(shù)解析了新型冠狀病毒S蛋白的結(jié)構(gòu)，深入研究后，研究者發(fā)現(xiàn)，新冠病毒S蛋白與宿主細胞ACE2之間的親和力是SARS的10-20倍，相關(guān)研究結(jié)果或為后期疫苗和新型抗病毒藥物的提供新的思路和研究基礎(chǔ)。
新型冠狀病毒S蛋白在融合前構(gòu)象中的結(jié)構(gòu)
圖片來源：Daniel Wrapp，et al.
據(jù)WHO 2月10日數(shù)據(jù)顯示，目前全球有超過4萬例確診病例，已經(jīng)造成了至少900人死亡，這種冠狀病毒被認為是一種新型冠狀病毒（2019-nCoV），其與多種蝙蝠冠狀病毒及SARS冠狀病毒具有高度相似性；相比SARS冠狀病毒而言，新型冠狀病毒似乎更容易人傳人，其能在幾個大洲快速傳播，并讓WHO宣布全球進入公共衛(wèi)生應急狀態(tài)。新型冠狀病毒能利用一種緊密糖基化的、同源三聚體I類融合凸起蛋白（S蛋白）來進入宿主細胞中，S蛋白能以一種相對穩(wěn)定的融合前構(gòu)象存在，并經(jīng)歷劇烈的結(jié)構(gòu)重排來促進病毒膜結(jié)構(gòu)與宿主細胞膜進行融合，這一過程是由病毒S1亞單位與宿主受體的結(jié)合所誘發(fā)，其能破壞融合前三聚體的穩(wěn)定性，從而導致S1亞單位脫落，并促使S2亞單位轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨确€(wěn)定的融合后構(gòu)象。為了能與宿主受體相結(jié)合，S1的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域會經(jīng)歷鏈狀樣的構(gòu)象運動，這種運動方式會暫時隱藏或暴露受體結(jié)合的決定因素，這兩種狀態(tài)被認為是“向上”或“向下”構(gòu)象，其中向下的構(gòu)象對應的是受體不可及的狀態(tài)，而向上構(gòu)象則對應著受體可達的狀態(tài)，后者被認為具有不穩(wěn)定。由于S蛋白不可或缺的功能，因此其有望成為抗體所介導的中和作用的易感性靶點，而融合前的S結(jié)構(gòu)則能夠提供原子水平的信息來幫助指導科學家們進行疫苗的設(shè)計和開發(fā)。
基于此前研究人員所報道的新型冠狀病毒基因組序列，這項研究中，研究人員表達了新型冠狀病毒的胞外域1-1208的殘基，同時基于此前的穩(wěn)定化策略（對β冠狀病毒S蛋白非常有效）在S2融合機器的C末端添加了兩個穩(wěn)定的脯氨酸突變，研究者從293個細胞中獲得了約為0.5mg/L的重組融合前穩(wěn)定的S胞外域結(jié)構(gòu)，同時利用親和色譜和尺寸排阻色譜技術(shù)對蛋白質(zhì)進行了純化，隨后研究者利用純化且完全糖基化的S蛋白制備了Cryo-EM（冷凍電鏡）網(wǎng)格。
當研究人員收集并加工處理了3207張顯微照片后，他們獲得了一個3.5埃分辨率的3D非對稱三聚體的重建圖像，其中能在“向上”的結(jié)構(gòu)域中觀察到單一的受體結(jié)合域，由于受體結(jié)合域的尺寸較?。?-21kDa），因此在進行三維重建和分類之前，這種構(gòu)象的對稱性或許并不明顯。在cryoSPARC v2算法中3D可變性特征的幫助下，研究人員就能夠在受體結(jié)合域進行鏈狀移動時觀察到S1亞單位的結(jié)構(gòu)，這種運動或許就會導致S1相對于更穩(wěn)定的S2而言表現(xiàn)出局部分辨率較低的狀況。這種看似隨機的受體結(jié)合域移動也能夠在SARS冠狀病毒MERS冠狀病毒，甚至親緣關(guān)系較遠的豬流行性腹瀉病毒中都能觀察到，在新型冠狀病毒S蛋白中所觀察到的結(jié)果就表明，其或許擁有被認為在冠狀病毒科保守的相同誘發(fā)機制，其中受體與暴露的受體結(jié)合域的結(jié)合會引發(fā)不穩(wěn)定構(gòu)象的產(chǎn)生，從而導致S1亞單位脫落，S2亞蛋白重新發(fā)生折疊。
由于S2亞單位似乎是一種對稱的三聚體，因此研究人員對其進行了3D精細化處理使其具有C3對稱性，這樣就生成了一個3.2埃分辨率的圖譜，其所呈現(xiàn)的S2亞單位的致密度較好，利用上述圖譜，研究人員構(gòu)建了新型冠狀病毒的大部分胞外域區(qū)域，其中包括每個三聚體上的66個連接糖基化位點中的44個糖基化位點，研究者所得到的模型跨越了S殘基22-1146（位點），其中省略了一些靈活的環(huán)路；與此前所報道的所有冠狀病毒的胞外域結(jié)構(gòu)一樣，新型冠狀病毒S蛋白的密度在連接域后也開始下降，從而就反映出了融合前構(gòu)象中七肽重復區(qū)2結(jié)構(gòu)域（HR2，heptad repeat 2）的靈活性。
新型冠狀病毒S蛋白的整體結(jié)構(gòu)類似于SARS冠狀病毒S蛋白的結(jié)構(gòu)，其二者在超過959個Cα原子上的均方根偏差（RMSD）為3.8埃（A），它們之間在結(jié)構(gòu)上較大的差異是其各自“向下”構(gòu)象中受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域位置之間的構(gòu)象差異，處于“向下”構(gòu)象的SARS冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域能與相鄰原聚體的N末端結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，而新型冠狀病毒的的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的角度則更接近同源三聚體的中心腔位置；盡管存在一定的構(gòu)象差異，但當新型冠狀病毒S蛋白的單一結(jié)構(gòu)域與SARS冠狀病毒S蛋白對應結(jié)構(gòu)域?qū)R時，它們就能夠反映兩種蛋白之間較高程度的結(jié)構(gòu)同源性。
新型冠狀病毒與蝙蝠冠狀病毒RaTG13的S蛋白的序列同源性大約為96%，明顯的變化源于S1/S2蛋白酶切割位點的插入，從而導致新型冠狀病毒出現(xiàn)了“RRAR”成對堿性氨基酸蛋白酶的識別位點，而不是SARS冠狀病毒中的單一精氨酸位點；目前研究人員已經(jīng)在流感病毒中觀察到了類似的現(xiàn)象，即在高毒性禽流感病毒和人流感病毒中的相關(guān)位置所發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)生多元成對堿性氨基酸蛋白酶位點的氨基酸插入。除了S1/S2連接處插入的殘基外，新型冠狀病毒的S蛋白和RaTG13的S蛋白之間還存在29個可變的殘基，其中17個殘基位置能夠映射到受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中；隨后研究人員分析了來自全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織（GISAID）中61個可用的新型冠狀病毒S蛋白的序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有序列中僅存在9個氨基酸的替換，大部分替換都是保守性的，而且研究者預測，其也不會對新型冠狀病毒的S蛋白的功能或結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。
有研究表明，新型冠狀病毒的S蛋白和SARS冠狀病毒S蛋白擁有相同功能的宿主細胞受體，即血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2，angiotensin converting enzyme2），這就促使了研究人員通過表面等離子體共振技術(shù)（SPR，surface plasmon resonance）來研究介導這種相互作用的動力學特性，讓研究人員驚訝的是，ACE2與新型冠狀病毒S蛋白胞外域結(jié)構(gòu)之間結(jié)合的親和力為15 nM（平衡解離常數(shù)），其是ACE2與SARS冠狀病毒S蛋白胞外域結(jié)構(gòu)之間結(jié)合親和力的10-20倍。 此外，研究人員還制造了ACE2與新型冠狀病毒S蛋白胞外域結(jié)合的復合體，并利用負染色電鏡技術(shù)對其進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該復合體與SARS冠狀病毒S蛋白-ACE2復合體的結(jié)構(gòu)（利用高分辨率的冷凍電鏡技術(shù)觀察）非常相似；新型冠狀病毒對人類ACE2的高親和力或許有助于解釋為何該病毒易于在人與人之間進行傳播擴散，但后期還需要研究人員進一步深入研究來闡明。
新型冠狀病毒S蛋白和SARS冠狀病毒S蛋白之間總體的結(jié)構(gòu)同源性和共享受體使用或能幫助我們檢測已經(jīng)公布的SARS冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域定向單克隆抗體與新型冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的交叉反應特性；目前研究者已經(jīng)對新型冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的SD1片段（S蛋白殘基319-591）進行了重組表達，并利用生物層干涉技術(shù)（BLI）測定ACE2的結(jié)合水平來證實這種重組體的折疊狀況，隨后研究者利用BLI來評估SARS冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域定向單克隆抗體S230、m396和80R的交叉反應特性。盡管新型冠狀病毒和SARS冠狀病毒的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)同源性程度較高，但在1uM的測定濃度下，研究者并未發(fā)現(xiàn)上述三種抗體與新型冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，盡管三種抗體的抗原表位僅代表了新型冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域較小比例的表面面積，目前缺乏研究證據(jù)表明，SARS定向的單克隆抗體不一定具有交叉反應性，而后期研究人員或許也能利用新型冠狀病毒的S蛋白作為探針來進行抗體的分離和治療研究等工作。
新型冠狀病毒在全球的傳播擴散促使WHO將其認定為國際公共衛(wèi)生緊急事件，目前研究人員迫切需要開發(fā)出針對該病毒的新型疫苗和治療手段，而在原子水平下闡明新型冠狀病毒S蛋白的精細化結(jié)構(gòu)或有望幫助后期開發(fā)出新型抗病毒療法和疫苗。
參考資料：
Daniel Wrapp， Nianshuang Wang， Kizzmekia S. Corbett， et al. Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation， bioRxiv (2020) doi：10.1101/2020.02.11.944462
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