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  南方科技大學(xué)：前沿研究！可抑制肝細(xì)胞癌的致瘤表型
  
  2023-07-03 來源：轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)
  
  導(dǎo)讀：在包括肝細(xì)胞癌(HCC)在內(nèi)的多種癌癥中，腫瘤干細(xì)胞(CSCs)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)。CSCs的表觀遺傳重編程已成為誘導(dǎo)從惡性到良性轉(zhuǎn)變的一種有前途的策略。
  
  具有PHD和無名指結(jié)構(gòu)域1 (UHRF1)的泛素樣蛋白是DNA甲基化遺傳所必需的。在此，我們研究了UHRF1在調(diào)節(jié)CSC性質(zhì)中的作用和機(jī)制，并評估了UHRF1靶向?qū)CC的影響。在二乙基亞硝胺(DEN)/ ccl4誘導(dǎo)和myc轉(zhuǎn)基因肝癌小鼠模型中，肝細(xì)胞特異性Uhrf1敲除(UHRF1HKO)強(qiáng)烈抑制腫瘤的發(fā)生和CSC的自我更新。在人HCC細(xì)胞系中消融UHRF1產(chǎn)生一致的表型。整合RNA-seq和全基因組亞硫酸氫鹽測序揭示了UHRF1沉默表觀遺傳重編程癌細(xì)胞誘導(dǎo)的廣泛的低甲基化，使其分化和腫瘤抑制。在機(jī)制上，UHRF1缺陷上調(diào)了CEBPA，隨后抑制了GLI1和Hedgehog信號傳導(dǎo)。在myc驅(qū)動(dòng)的HCC小鼠中，給藥一種潛在的UHRF1抑制劑——檜木醇可以顯著降低腫瘤生長和CSC表型。具有病理生理意義的是，UHRF1、GLI1和關(guān)鍵軸蛋白在小鼠和HCC患者肝臟中的表達(dá)水平持續(xù)升高。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了UHRF1在肝CSCs中的調(diào)控機(jī)制，并對HCC治療策略的發(fā)展具有重要意義。
  
  研究背景
  
  肝細(xì)胞癌(HCC)占原發(fā)性肝癌病例的75-85%。HCC相關(guān)死亡率高的部分原因是晚期HCC患者比例高且缺乏有效治療。因此，迫切需要新的治療策略。
  
  腫瘤干細(xì)胞(CSC)或腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞模型表明，腫瘤內(nèi)具有自我更新和分化特征的干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群負(fù)責(zé)腫瘤的啟動(dòng)，治療抵抗和復(fù)發(fā)。這些罕見的細(xì)胞已經(jīng)在包括HCC在內(nèi)的各種癌癥類型中被報(bào)道，并且已經(jīng)鑒定出幾種CSC標(biāo)記物，如CD44和CD133。肝CSC表現(xiàn)出Wnt/β-catenin、Hedgehog和Notch信號通路的頻繁激活，這些信號通路在肝臟發(fā)育、肝臟生長和肝CSC自我更新中發(fā)揮重要作用。此外，SOX2、c-MYC等與干細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在肝癌中也有異常表達(dá)。與正常組織干細(xì)胞類似，高惡性的CSCs可以轉(zhuǎn)化為低致瘤性的分化細(xì)胞。CSC的這種可塑性可以通過分化治療來消耗CSC亞群和根除癌癥。
  
  現(xiàn)有證據(jù)表明，DNA甲基化重編程是一種關(guān)鍵的表觀遺傳機(jī)制，在CSC可塑性中起著至關(guān)重要的作用。DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3a和DNMT3b誘導(dǎo)的。在細(xì)胞分裂過程中，具有PHD和無名指結(jié)構(gòu)域1的泛素樣蛋白(UHRF1)將DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1 (DNMT1)招募到半甲基化的DNA位點(diǎn)，并維持DNA甲基化，從而使子細(xì)胞繼承DNA甲基化模式。既往研究報(bào)道，消融UHRF1可導(dǎo)致不同成體干細(xì)胞分化。近期，Hu等報(bào)道靶向UHRF1可根除髓系白血病中的白血病起始細(xì)胞，揭示了UHRF1在維持癌起始細(xì)胞中的作用。UHRF1在幾種類型的癌癥中經(jīng)常過表達(dá)，并在癌癥進(jìn)展中起致瘤作用。然而，UHRF1在肝臟中調(diào)節(jié)CSC特性的功能作用和機(jī)制尚不清楚。雖然已經(jīng)有一些關(guān)于UHRF1在肝損傷和癌癥中的研究，但大多數(shù)結(jié)果都是在體外的HCC細(xì)胞中獲得的。對于模式生物的體內(nèi)數(shù)據(jù)，有些發(fā)現(xiàn)似乎不一致甚至相互矛盾。例如，在斑馬魚肝細(xì)胞中，UHRF1過表達(dá)會通過破壞Dnmt1的穩(wěn)定和離域?qū)е翫NA低甲基化，而Magnani等人發(fā)現(xiàn)，UHRF1的缺失也會導(dǎo)致斑馬魚肝臟中DNA甲基化丟失。此外，uhrf1缺失引起的DNA低甲基化誘導(dǎo)了斑馬魚轉(zhuǎn)座元件的激活和干擾素反應(yīng)，但在UHRF1缺失小鼠中，通過H3K27me3的重新分配，轉(zhuǎn)座元件被抑制。因此，有必要在堿基分辨率上描述UHRF1耗竭時(shí)的甲基組，并研究由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄重編程。此外，還需要體內(nèi)模型和數(shù)據(jù)來確定UHRF1是否可以作為HCC的治療靶點(diǎn)。
  
  在這里，我們證明了UHRF1作為一種表觀遺傳調(diào)節(jié)劑，通過GLI1/Hedgehog和Wnt信號重編程CSCs向分化和腫瘤抑制方向發(fā)展。此外，通過基因敲除或藥物抑制來消融UHRF1可減輕小鼠的肝癌發(fā)生和CSC表型。我們的研究結(jié)果提供了機(jī)制見解，并確定了UHRF1作為肝癌治療的潛在靶點(diǎn)。
  
  研究過程
  
  臨床樣本
  
  在知情同意的情況下，從中山大學(xué)腫瘤中心(中國廣州)接受肝切除術(shù)的患者中收集原發(fā)性HCC標(biāo)本和配對的非腫瘤組織。采用75對冷凍原發(fā)腫瘤及鄰近非腫瘤組織(隊(duì)列1)反轉(zhuǎn)錄定量PCR (RT-qPCR)分析mRNA表達(dá)，8對western blotting (WB)分析蛋白表達(dá)。采用組織微陣列(TMA)包含177個(gè)原發(fā)性HCC腫瘤組織(隊(duì)列2)用于免疫組化檢測蛋白表達(dá)。本研究使用的臨床標(biāo)本經(jīng)中山大學(xué)癌癥中心人體受試者研究倫理審查委員會批準(zhǔn)。
  
  動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
  
  所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)南方科技大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物愛護(hù)與利用委員會審核通過。所有小鼠均具有C57bl/6基因背景。通過將UHRF1flox/flox小鼠(上海模式生物中心)與白蛋白cre (Alb-Cre)小鼠(上海模式生物中心)雜交獲得肝細(xì)胞特異性UHRF1敲除(UHRF1HKO)小鼠。得到的UHRF1flox/floxAlb-Cre小鼠為實(shí)驗(yàn)組(n = 6)， UHRF1flox/flox小鼠為對照組(n = 5)。在這項(xiàng)研究中只使用了雄性小鼠。
  
  為了建立纖維化相關(guān)性HCC模型，在出生兩周內(nèi)腹腔注射20 mg/kg DEN (Sigma， # 0258-1g)以初始化HCC過程。然后，四氯化碳(CCl4)(5μl/g體重，用橄欖油稀釋)在間隔6周后每周腹腔注射兩次，以促進(jìn)HCC的進(jìn)展。從兩組小鼠身上采集組織。第一組為5只對照小鼠，7個(gè)月時(shí)處死6只Uhrf1HKOmice，用于評價(jià)敲除UHRF1對HCC癌變的影響。第二組分別于4、5、6、7月齡處死3只對照組小鼠和3只UHRF1HKO小鼠。該隊(duì)列用于跟蹤UHRF1在HCC癌變不同階段的表達(dá)。收集肝組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
  
  為了建立Myc驅(qū)動(dòng)的HCC模型，將hip11 -stopflox/flox-Myc小鼠(上海模式生物中心)與白蛋白cre小鼠雜交，產(chǎn)生肝細(xì)胞特異性Myc敲入小鼠(MycHKI/+)。通過將UHRF1flox/floxAlbCre/+和UHRF1flox/floxMycHKI/+小鼠雜交產(chǎn)生肝臟特異性UHRF1基因敲除小鼠(UHRF1HKOMycHKI/+)。UHRF1HKOMycHKI/+小鼠為實(shí)驗(yàn)組(n = 6)， MycHKI/+小鼠為對照組(n = 6)。9周齡處死小鼠，收集肝組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
  
  對于扁桃酚治療，MycHKI/+小鼠從出生4 ~ 9周開始，每周2次腹腔注射載體(對照組，n = 6)或25 mg/kg扁桃酚(治療組，n = 8)。9周齡處死小鼠，收集肝組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
  
  統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)
  
  采用SPSS和GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用非配對學(xué)生t檢驗(yàn)來檢查任何兩個(gè)預(yù)選組之間的差異。生存率差異采用Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析。采用Spearman相關(guān)分析分析兩個(gè)統(tǒng)計(jì)變量之間的相關(guān)性。結(jié)果表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  
  研究結(jié)果
  
  肝細(xì)胞特異性敲除UHRF1可減輕DEN/ ccl4誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生
  
  為了研究UHRF1功能喪失對HCC發(fā)生和進(jìn)展的影響，我們通過將UHRF1flox/flox小鼠與白蛋白cre小鼠雜交，產(chǎn)生了肝細(xì)胞特異性UHRF1敲除小鼠(UhRF1HKO)。UHRF1HKO小鼠正常發(fā)育為可存活的成年小鼠，在體重、肝臟大體外觀或組織學(xué)評估的肝臟結(jié)構(gòu)方面與年齡匹配的對照組小鼠沒有差異。通過單次注射DEN然后重復(fù)給藥CCl4誘導(dǎo)纖維化相關(guān)小鼠肝癌發(fā)生，100%的小鼠在7月齡時(shí)發(fā)生肝臟腫瘤(圖1A和S1A)。在UHRF1HKO肝臟中，UHRF1 mRNA表達(dá)(圖S1B)和蛋白水平(圖1B)均顯著降低，證明了這種敲除策略的有效性。敲除Uhrf1顯著降低了腫瘤的發(fā)生率和體積，而對照小鼠的肝臟則被多個(gè)腫瘤占據(jù)(圖1A和S1A)。蘇木精和伊紅(H&E)染色證實(shí)了相應(yīng)肝組織的組織學(xué)結(jié)構(gòu)(圖1C)。在UHRF1HKO小鼠中檢測到腫瘤數(shù)量、肝臟重量和肝臟體重比明顯下降，其中三只沒有形成腫瘤(圖1D)。DEN/ ccl4誘導(dǎo)HCC的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，UHRF1敲除后958個(gè)基因下調(diào)(圖S1C)，其中Wnt信號通路富集(圖1E和S1E)。共有551個(gè)基因在分子分解代謝和代謝過程中被上調(diào)和富集(圖S1C和D)。此外，UHRF1的缺失降低了已知CSC特征基因(Cd24、Cd44、Cd133、Epcam、Krt19、Afp、Anpep、Icam1、Foxm1、Dlk1、Gpc3、Mycn、Sox9和Hnf4a)的表達(dá)(圖1F)，其中Foxm1被報(bào)道促進(jìn)了UHRF1的表達(dá)[23]。相反，UHRF1的缺失增強(qiáng)了與肝細(xì)胞分化相關(guān)的基因(E2f7、E2f8、Cps1和Pck1)的表達(dá)(圖1F)。這些體內(nèi)結(jié)果表明，UHRF1基因敲除可能通過調(diào)節(jié)肝CSCs的自我更新和分化，強(qiáng)烈地減弱了肝癌的發(fā)生。
  
  肝細(xì)胞特異性敲除Uhrf1可減輕DEN/ ccl4誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生
  
  UHRF1是維持CSC表型所必需的
  
  先前的研究已經(jīng)確定了癌癥中干細(xì)胞和分化的基因表達(dá)特征。Yamashita等人發(fā)現(xiàn)，在肝干細(xì)胞樣hcc中，一個(gè)基因簇表達(dá)上調(diào)，一個(gè)基因簇表達(dá)下調(diào)，與成熟肝細(xì)胞功能相關(guān)。Rhodes等人描述了在各種類型的未分化癌癥中通常被激活的轉(zhuǎn)錄譜[24,25]?；蚣患治鲲@示，上述兩個(gè)干細(xì)胞相關(guān)基因集在UHRF1 mRNA高表達(dá)的腫瘤中呈正富集，而在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中的UHRF1 mRNA高表達(dá)的患者中，分化相關(guān)基因集呈負(fù)富集(圖2A)。此外，UHRF1的表達(dá)與典型Hedgehog和Wnt信號通路的激活呈正相關(guān)(圖S2A)。我們之前建立了體外肝細(xì)胞分化模型[26]，發(fā)現(xiàn)UHRF1在肝臟發(fā)育和腫瘤發(fā)生過程中表現(xiàn)出類似癌胚的基因表達(dá)模式(圖2B)。這些發(fā)現(xiàn)表明，UHRF1調(diào)節(jié)腫瘤起始細(xì)胞的干性。支持這一觀點(diǎn)的是，在小鼠模型中，UHRF1的表達(dá)水平在HCC發(fā)病過程中逐漸升高，同時(shí)CD133和CD44蛋白水平升高，而UHRF1的缺失幾乎完全消除了這種升高(圖2C、D和S2B)。為了進(jìn)一步研究UHRF1是否影響人肝臟CSC屬性，我們在SNU-449和CRL-8024 HCC細(xì)胞系中建立了穩(wěn)定的UHRF1敲低或過表達(dá)(圖S2C和S3A)。UHRF1的異位過表達(dá)并不影響腫瘤細(xì)胞的增殖或遷移，這可能是由于功能冗余(圖S3B-D)。相比之下，UHRF1沉默顯著降低了致瘤性和遷移(圖S2D-F)。球體形成實(shí)驗(yàn)顯示，UHRF1沉默顯著減少了干細(xì)胞形成的球體數(shù)量(圖2E)。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，UHRF1敲除細(xì)胞中CD44+CD133+肝CSCs的比例低于對照細(xì)胞(圖2F)。同樣，在UHRF1耗盡后，CD133和CD44的免疫熒光信號顯著降低(圖2G)?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明UHRF1在CSC維持中起關(guān)鍵作用。
  
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