重大發(fā)現！北京大學團隊發(fā)現抑制結腸癌新靶點
在本研究中，lncRNA miR663AHG的亞細胞定位是通過RNA-FISH來確定的。采用qRT-PCR檢測miR663AHG和miR663a。體外和體內研究miR663AHG對結腸癌細胞生長和轉移的影響。利用CRISPR/Cas9、RNA pulldown等生物學檢測方法探索miR663AHG的潛在機制。我們發(fā)現miR663AHG主要分布在Caco2和HCT116細胞的細胞核以及SW480細胞的細胞質中。
119例患者結腸癌組織中miR663AHG的表達水平與miR663a的表達水平呈正相關(r = 0.179, P = 0.015)，與配對的正常組織相比，miR663AHG的表達水平顯著下調(P < 0.008)。miR663AHG低表達的結腸癌與pTNM晚期(P = 0.021)、淋巴轉移(P = 0.041)和較短的總生存期相關(風險比= 2.026;p = 0.021)。實驗表明，miR663AHG抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。過表達miR663AHG的RKO細胞移植物在BALB/c裸鼠體內的生長速度慢于載體對照細胞(P = 0.007)。有趣的是，無論是rna干擾還是白藜蘆醇誘導miR663AHG或miR663a的表達變化，都可以觸發(fā)miR663AHG基因轉錄的負反饋調控。在機制上，miR663AHG可以結合miR663a及其前體pre-miR663a，阻止miR663a靶mrna的降解。通過敲除MIR663AHG啟動子、外顯子1和pri- miR663a編碼序列來破壞負反饋，完全阻斷了MIR663AHG的這些作用，在轉染miR663a表達載體的細胞中恢復了MIR663AHG的這些作用。綜上所述，miR663AHG作為腫瘤抑制因子，通過與miR663a/pre-miR663a的順式結合抑制結腸癌的發(fā)展。miR663AHG和miR663a表達之間的串擾可能在維持miR663AHG在結腸癌發(fā)展中的功能中起主導作用。
研究背景
結腸癌是世界上死亡率僅次于肺癌的惡性疾病。預計到2022年，美國將有近10萬名新診斷的結腸癌患者，死亡率將達到約8.6%。雖然DNA甲基化標記篩查、結腸鏡檢查和結腸粘膜息肉切除術的普及在早期診斷和預防方面取得了長足進展，但50歲以下人群的結腸癌發(fā)病率仍在穩(wěn)步上升。對其機制的深入研究可能會加快結腸癌發(fā)生機制的闡明。
隨著高通量RNA測序(RNA-seq)技術的發(fā)展，人們發(fā)現從人類基因組中轉錄出大量的非編碼RNA (ncRNA)分子。長鏈非編碼rna (lncRNAs)可以調節(jié)染色質構象、基因轉錄、hnRNA剪接以及其他生物過程，如癌癥的發(fā)生。許多l(xiāng)ncrna在癌組織中的表達狀態(tài)異常。一些因素直接影響癌細胞的增殖、凋亡、轉移、血管生成、耐藥和干細胞的干性。此外，ncrna具有組織特異性和腫瘤特異性表達模式，有望成為患者糞便、血清/血漿和組織樣本中潛在的結直腸癌篩查、診斷和預后生物標志物。
MIR663AHG是一個罕見的人類特異性基因(Entrez gene: 284801)，位于20號染色體的著絲粒上。該基因的初級轉錄本(hnRNA)可以同時剪接成microRNA miR663a和lncRNA miR663AHG。我們之前報道過miR663a在結腸癌組織中表達下調，miR663a抑制結腸癌細胞的生長和轉移。相關研究表明miR663AHG表達的變化與椎間盤退變(IDD)的發(fā)生有關。另一項研究發(fā)現，miR663AHG在銀屑病組織中下調。根據基因型-組織表達計劃(GTEx)項目數據庫，miR663AHG在人類各種正常組織中普遍表達，并具有相對豐度。然而，miR663AHG的生物學功能此前未見報道。在本研究中，我們首次研究了miR663AHG在結腸癌發(fā)生中的作用及其分子機制。
研究結果
miR663AHG的表征及其亞細胞分布
與蛋白質編碼基因相比，ncRNA基因的轉錄起始位點(transcription start sites, tss)更加多樣化。MIR663AHG是一個多外顯子基因。miR663a和miR663AHG是由相同的hnRNA拼接而成的。在PhyloCSF分析中，miR663AHG的值小于零，表明該lncRNA不編碼蛋白質。
lncRNA miR663AHG的表征
整個患者隊列中研究參與者的人口學特征
眾所周知，基因轉錄受轉錄起始位點(tss)周圍CpG島甲基化狀態(tài)的調控。一個CpG島位于MIR663AHG TSS周圍。根據CCLE DNA甲基化和RNA-seq數據庫的挖掘結果，高甲基化水平細胞系的miR663AHG和miR663a水平顯著低于中、低甲基化水平細胞系(P < 0.05)。這表明MIR663AHG基因的轉錄受DNA甲基化調控。
在真核細胞中，lncrna的功能與其亞細胞定位密切相關。為了表征miR663AHG在結腸癌細胞中的分布規(guī)律，我們采用qRT-PCR方法初步測定了miR663AHG在6種結腸癌細胞系中的基線表達狀態(tài)。miR663AHG水平在Caco2或SW620細胞中高于HCT116或RKO細胞，在SW480和LoVo細胞中較低。同樣，miR663a水平在SW620細胞中較高，在SW480細胞中較低(數據未顯示)。RNA-FISH分析結果顯示，miR663AHG位于結腸癌細胞的細胞質和細胞核中，主要位于Caco2和HCT116細胞的細胞核中，以及SW480細胞的細胞質中。在LoVo細胞中未檢測到miR663AHG雜交信號。
miR663AHG在體內外均抑制結腸癌細胞的生長和轉移
為了研究miR663AHG的生物學功能，我們將miR663AHG基線表達水平較低的兩株人結腸癌細胞株SW480和LoVo穩(wěn)定轉染miR663AHG慢病毒表達載體，而將miR663AHG基線表達水平較高的另外兩株細胞株SW620和HCT116轉染針對miR663AHG (si663AHG)的sirna。在長期動態(tài)觀察分析中，miR663AHG過表達顯著抑制SW480和LoVo細胞的增殖，而miR663AHG敲低則顯著促進SW620和HCT116細胞的增殖。miR663AHG過表達和敲低也誘導了類似的集落形成率差異，這些結果在動物模型中得到了證實。穩(wěn)定過表達miR663AHG的RKO細胞衍生的異種移植物生長明顯慢于空對照細胞(P = 0.009)。
miR663AHG在結腸癌中的下調與預后不良相關
我們之前報道了miR663a在結腸癌組織(CCs)中的表達相對于患者匹配的手術邊緣對照(SMs)顯著下調。有足夠RNA樣本用于miR663AHG檢測的患者(n = 119)被重新納入本研究。qRT-PCR分析結果顯示，與SMs相比，miR663AHG在cc中的表達顯著下調，特別是在有淋巴轉移或pTNM晚期或分化良好的cc中。
miR663AHG在不同臨床病理特征患者結腸癌組織樣本中的表達水平
Kaplan-Meier分析顯示，miR663AHG低表達(低于中位數)結腸癌患者的總生存期(OS)顯著短于miR663AHG高表達患者(P = 0.018)。單因素分析顯示，4個危險因素與這些患者的OS顯著相關。這些因素包括miR663 AHG低表達(風險比[HR]， 2.026;95%可信區(qū)間[CI]， 1.113-3.689)、pTNM分期、淋巴轉移和遠處轉移。然而，在多變量分析中，只有轉移狀態(tài)與患者的OS顯著相關，而miR663AHG水平與患者的OS無關。
此外，結合我們之前報道的miR663a數據，我們分析了這些結腸組織中miR663AHG和miR663a水平的相關性(n = 182;包括短信和短信)。兩者呈正相關(r = 0.179, P = 0.015)，表明miR663a可能參與miR663AHG的生物學功能。此外，我們還使用公共微陣列數據集分析了相關性，發(fā)現353例卵巢癌樣本之間存在類似的相關性(Spearman r = 0.168, P = 0.002)。
miR663AHG結合miR663a及其前體，保護miR663a靶標
為了探索miR663AHG在結腸癌發(fā)展中抑制作用的潛在潛在機制，我們使用StarBase v3.0數據庫進行了生物信息學分析。我們發(fā)現miR663AHG可能直接順式結合miR663a前體pre-miR663a(和pri-miR663a)。正如預期的那樣，RNA下拉分析結果顯示，生物素標記的miR663AHG確實與RKO細胞中的pre-miR663a(和pri-miR663a)結合，生物素標記的pre-miR663a也與miR663AHG結合。此外，生物素標記的miR663a在RKO細胞中也顯著富集miR663AHG。這些結果證實了miR663AHG可以直接結合miR663a及其前體。
在機制上，我們發(fā)現miR663AHG(或miR663a)表達的改變，無論是通過表達載體還是抗氧化白藜蘆醇處理誘導，都可以逆轉內源性miR663a(或miR663AHG)表達的改變，表明miR663AHG基因表達存在負反饋回路。然而，miR663AHG和miR663a都是由相同的初級轉錄物拼接而成。miR663AHG和miR663a在人體組織中表達的上述正相關表明，miR663AHG基因的轉錄活性應該是決定miR663AHG和miR663a在人體細胞中表達水平的主導因素，盡管它們的確切表達水平和生物學功能是相互負相關的。
綜上所述，我們的研究表明，lncRNA miR663AHG與miR663a及其前體pre-miR663a結合，誘導miR663a表達的負反饋。miR663AHG可能通過與miR663a及其前體的順式結合，在宿主對炎癥的防御反應和抑制結腸癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
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