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  新方法！前列腺癌精準(zhǔn)新模型，可用于臨床和藥物開發(fā)
  
  2023-07-24 來源：轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)
  
  前列腺癌的體外研究依賴于已建立的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系缺乏重要的生理特征，如適當(dāng)?shù)臉O化和相關(guān)生物標(biāo)志物的表達(dá)。微生理系統(tǒng)(MPS)可以復(fù)制癌癥微環(huán)境，并導(dǎo)致細(xì)胞表型變化，更好地代表體外器官生理。
  
  在這項研究中，研究團隊建立了一個由傳統(tǒng)前列腺癌細(xì)胞組成的MPS模型，以評估其在動態(tài)培養(yǎng)條件下的活性。雄激素敏感細(xì)胞(LNCaP)和雄激素不敏感細(xì)胞(PC3)分別在常規(guī)和3D培養(yǎng)中培養(yǎng)，包括靜態(tài)和動態(tài)培養(yǎng)。分析細(xì)胞形態(tài)、前列腺特異性抗原分泌、前列腺關(guān)鍵標(biāo)志物及MicroRNA的表達(dá)情況。LNCaP在3D和MPS培養(yǎng)中形成球狀體，細(xì)胞角蛋白和粘附蛋白的上調(diào)支持了形態(tài)變化。LNCaP在MPS中也保持恒定的前列腺特異性抗原分泌。PC3細(xì)胞在3D和MPS培養(yǎng)中沒有形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)?；蛩缴系腜SA表達(dá)在LNCaP-MPS中下調(diào)，在PC3-MPS中顯著上調(diào)。細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的三維靜態(tài)和動態(tài)培養(yǎng)改變了MicroRNA表達(dá)。與前列腺癌進(jìn)展相關(guān)的MicroRNA在LNCaP-MPS中大多上調(diào)。整體動態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)實質(zhì)上改變了LNCaP細(xì)胞的形態(tài)和表達(dá)，可以說是增加了它們的前列腺癌表型。這一新方法表明，前列腺癌細(xì)胞中的MicroRNA表達(dá)對外部刺激敏感，MPS可以有效促進(jìn)常規(guī)前列腺癌模型中的重要生理變化。
  
  研究背景
  
  前列腺癌(PCa)是2018年男性腫瘤死亡的第二大惡性腫瘤和第五大原因。在世界范圍內(nèi)，前列腺癌的患病率和死亡率與年齡的增長有關(guān)，估計65歲以上的發(fā)病率為60%。前列腺癌細(xì)胞的生長和存活起初依賴于雄激素，即睪酮，其活性形式與雄激素受體(AR)結(jié)合，并調(diào)節(jié)參與細(xì)胞增殖或凋亡逃避機制的多種蛋白質(zhì)的表達(dá)。雄激素剝奪療法(ADT)是一種標(biāo)準(zhǔn)的、廣泛使用的前列腺癌治療方法。ADT積極下調(diào)睪酮的合成，從而抑制前列腺癌的增殖。大約10-15%的PCa患者出現(xiàn)去勢抵抗，臨床預(yù)后較差，中位生存時間為12-23個月。當(dāng)惡性前列腺癌細(xì)胞在缺乏雄激素的情況下增殖，導(dǎo)致ADT無效時，去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)就會發(fā)生。CRPC的特征是連續(xù)三次分析中前列腺特異性抗原(PSA)增加，間隔至少一周，PSA水平> 2ng /ml或ADT后腫瘤放射學(xué)進(jìn)展。
  
  PSA是一種由前列腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生的與鉀化鉀素相關(guān)的絲氨酸蛋白酶。它作為篩查、診斷和隨訪前列腺癌的生物標(biāo)志物。生理上，PSA的分泌促進(jìn)精子的活動，其表達(dá)受AR調(diào)控。這一生物標(biāo)志物反映了前列腺細(xì)胞的增殖，PSA水平升高可提示癌細(xì)胞的存在。然而，盡管具有優(yōu)勢，PSA缺乏診斷特異性，不能指示疾病的嚴(yán)重程度或分期。良性前列腺疾病或損傷也可導(dǎo)致PSA水平升高。這說明需要更具體的PCa生物標(biāo)志物作為診斷和預(yù)后工具。
  
  MicroRNA (miR)已被確定為CRPC早期診斷的潛在生物標(biāo)志物，有望在去勢抵抗發(fā)生之前捕獲這種惡性腫瘤。一些MicroRNA(如miR-4417, miR-3687, miR-205)已被描述在CRPC進(jìn)展中具有功能作用。為了進(jìn)一步探索MicroRNA在PCa和CRPC之間的分子轉(zhuǎn)化中的作用，并驗證其作為CRPC臨床生物標(biāo)志物的應(yīng)用，需要臨床和臨床前的綜合研究。
  
  盡管在分子泌尿?qū)W研究中廣泛使用和貢獻(xiàn)了幾種細(xì)胞系(例如AR去調(diào)控)，但由于各種PCa和CRPC細(xì)胞中生物標(biāo)志物表達(dá)的高度可變性，它們在臨床相關(guān)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和驗證以及作為臨床前藥物測試的強大平臺方面的應(yīng)用存在主要限制。此外，常規(guī)培養(yǎng)(2D)中的細(xì)胞系不能復(fù)制腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性特征，不能維持上皮細(xì)胞的典型極性，并且關(guān)鍵細(xì)胞機制(如粘附蛋白、膜載體、代謝酶)的表達(dá)受到限制或缺失。
  
  微生理系統(tǒng)(MPS)的進(jìn)步使所謂的器官芯片得以引入，細(xì)胞在動態(tài)條件下培養(yǎng)。在MPS中，細(xì)胞暴露于不同的外部刺激(如流量、壓力、機械應(yīng)力等)，這些刺激促進(jìn)了2D中缺失的特征的分化。近年來的研究表明，多磺酸粘多糖能顯著改善上皮細(xì)胞的功能。在器官芯片模型中恢復(fù)的2D培養(yǎng)中一直缺失的顯著特征是陰離子藥物的分泌(腎臟)，腸道微生物組酶活性(腸道)和膽管形成(肝臟)。這些創(chuàng)新的體外平臺正迅速被用于需要更好地代表人體生理學(xué)的毒理學(xué)和藥學(xué)研究。近期試圖證明動態(tài)培養(yǎng)對前列腺細(xì)胞行為的影響已經(jīng)產(chǎn)生了有希望的結(jié)果。前列腺細(xì)胞可以在流體條件下保持活力。一項對雄激素敏感的LNCaP細(xì)胞的綜合研究表明，MPS中的球體促進(jìn)了細(xì)胞生長，改善了結(jié)構(gòu)完整性，減少了壞死核心的形成，并下調(diào)了細(xì)胞應(yīng)激基因的表達(dá)。流動培養(yǎng)的球狀體對化療的敏感性增加，并表現(xiàn)出更大的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
  
  在本研究中，我們旨在建立前列腺癌- MPS (PCa- MPS)模型，在體外重建PCa和CRPC細(xì)胞的上皮性質(zhì)以及它們的PSA和miRNA分泌。采用常用的LNCaP細(xì)胞作為雄激素敏感型PCa細(xì)胞的模型，PC3細(xì)胞作為雄激素不敏感型PCa細(xì)胞的模型。在MPS模型中探索這些細(xì)胞的潛力，為研究PCa生物標(biāo)志物提供了一種新的、生理學(xué)上更準(zhǔn)確的工具，可用于臨床實踐和藥物開發(fā)應(yīng)用。
  
  研究結(jié)果
  
  三維和MPS條件改變前列腺癌細(xì)胞的形態(tài)
  
  在我們的研究中使用的MPS芯片使兩個培養(yǎng)室之間的脈動流動在一個閉環(huán)中，這些刺激意味著培養(yǎng)基不斷地在細(xì)胞上再灌注，ECM水凝膠在每個灌注周期中收縮。在3D(靜態(tài))和MPS培養(yǎng)中，LNCaP細(xì)胞生長成非空心球體，相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)，極化明顯增加。在LNCaP球體中，表皮生長因子受體(EGFR)主要在細(xì)胞表面表達(dá)，而2D培養(yǎng)中，表皮生長因子受體分散在細(xì)胞質(zhì)中。黏附蛋白ZO1的密度在MPS培養(yǎng)的細(xì)胞中也比在2D中更為明顯，強調(diào)了球體的黏附增強。PC3細(xì)胞在MPS培養(yǎng)中未形成三維結(jié)構(gòu)。盡管如此，EGFR的表達(dá)似乎集中在凝膠中單個細(xì)胞的周圍。這表明，相對于EGFR分散在細(xì)胞質(zhì)中的2D細(xì)胞，這些細(xì)胞的極性增強。在2D中，PC3細(xì)胞相互粘附，從細(xì)胞邊界的ZO1表達(dá)可見一斑，這一特征在MPS培養(yǎng)中被排除在外。
  
  HUMIMIC芯片2微生理系統(tǒng)
  
  通過使用常規(guī)細(xì)胞系對PCa- MPS模型進(jìn)行表征，我們展示了使用先進(jìn)的體外系統(tǒng)研究PCa和CRPC細(xì)胞表型變化和MicroRNA分泌的潛力。MPS模型，如TissUse HUMIMIC芯片，受到低實驗吞吐量的限制，然而，當(dāng)用于解決特定的研究問題時，可以作為一個強大的工具。使用新一代測序(NGS)等方法來繪制非編碼RNA的表達(dá)圖譜已被證明可以大大增加基于MPS的實驗的實驗輸出。這些方法可以從有限數(shù)量的樣本中生成全面的數(shù)據(jù)集，從而較大限度地發(fā)揮復(fù)雜和勞動密集型微流體平臺的效用。使用該系統(tǒng)的進(jìn)一步研究可以研究PCa和CRPC細(xì)胞暴露于批準(zhǔn)的治療(如阿比特龍和恩雜魯胺)期間和之后的MicroRNA分泌。隨著時間的推移，MicroRNA分泌的改變可以通過誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的雄激素抵抗來實現(xiàn)。該模型在研究循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇(CTC)作為前列腺癌(PCa)預(yù)后工具方面也具有優(yōu)勢。CTC與癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)，將患者活檢獲得的PCa組織外植體整合到微生理系統(tǒng)(MPS)中，有可能研究CTC的起源及其與PCa進(jìn)展的相關(guān)性。在MPS中使用患者材料提供了額外的優(yōu)勢，因為它保留了PCa的異質(zhì)性，并實現(xiàn)了事實上的離體培養(yǎng)。通過提供一個生理學(xué)上更相關(guān)的模型，PCa-MPS可以潛在地克服目前體外模型的局限性，盡管如此，需要全面的表征工作來了解動態(tài)培養(yǎng)中激素敏感和不敏感前列腺癌細(xì)胞的界限。
  
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