Science：RNA疫苗讓claudin-CAR-T細(xì)胞更有效地抵抗實體瘤
盡管用經(jīng)過基因改造后表達嵌合抗原受體（CAR）的T細(xì)胞（CAR-T細(xì)胞）治療B細(xì)胞惡性腫瘤的臨床應(yīng)用取得了成功，但是細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）卻阻礙了這種療法在患者中的有效性。眾所周知，CRS是由急性炎癥反應(yīng)觸發(fā)的，其特征是發(fā)燒、低血壓和與血清細(xì)胞因子升高有關(guān)的呼吸功能不全。盡管人們已報道在經(jīng)過CAR-T細(xì)胞治療的人源化小鼠模型中，巨噬細(xì)胞參與了CRS的發(fā)病機制，但觸發(fā)CRS的機制尚不清楚。輸注到患者體內(nèi)的CAR-T細(xì)胞經(jīng)歷活化和增殖，快速增殖的CAR-T細(xì)胞可能會在短時間內(nèi)導(dǎo)致B白血病細(xì)胞迅速大量死亡。巧合的是，急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）患者的疾病負(fù)擔(dān)也與CRS的發(fā)生率和嚴(yán)重程度密切相關(guān)。如此大規(guī)模的惡性B細(xì)胞死亡參與CRS發(fā)病機制的方式仍不明確。
細(xì)胞可以經(jīng)歷不同類型的死亡。細(xì)胞凋亡初被認(rèn)為是少有的受到調(diào)控的程序性死亡形式。但是，近期研究已證實了一種以前未被識別的程序性壞死，其特征是細(xì)胞快速腫脹、質(zhì)膜上出現(xiàn)較大的氣泡以及促炎因子釋放。至少已鑒定出兩種程序性壞死細(xì)胞死亡途徑，包括MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡（necroptosis）和GSDMD（Gasdermin D）或GSDME（Gasdermin E）介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡（pyroptosis）。將RIPK1招募到TNF-α受體上可與RIP3形成一種死亡復(fù)合物，隨后產(chǎn)生膜納米孔，從而導(dǎo)致壞死性凋亡。不同于MLKL的是，GSDMD或GSDME由炎性半胱天冬酶（caspase 1、caspase 4、caspase 5和小鼠caspase 11）或caspase 3激活，可產(chǎn)生插入到細(xì)胞膜中的寡聚物而形成納米孔，因而介導(dǎo)細(xì)胞焦亡。
在一項新的研究中，來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、鄭州大學(xué)、華中科技大學(xué)和北京大學(xué)的研究人員提供的證據(jù)表明，人類B白血病細(xì)胞和其他靶腫瘤細(xì)胞表達了足夠數(shù)量的GSDME，所表達的GSDME可被由CAR-T細(xì)胞釋放的顆粒酶B激活的caspase 3高效激活，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞遭受細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡釋放的因子刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，這很可能觸發(fā)接受CAR-T細(xì)胞治療的患者中發(fā)生的CRS。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2020年1月17日的Science Immunology期刊上，論文標(biāo)題為“Gasdermin E–mediated target cell pyroptosis by CAR T cells triggers cytokine release syndrome”。
這些研究人員發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞由于釋放大量穿孔素和顆粒酶B而激活了B白血病細(xì)胞中的caspase 3-GSDME途徑，從而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡和隨后的CRS。已觀察到CAR-T細(xì)胞經(jīng)歷增殖過程并在體內(nèi)的某個時間點達到極高的增殖頻率。因此，在相對較短的時間內(nèi)，大多數(shù)靶細(xì)胞可能會經(jīng)歷細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致受到激活的巨噬細(xì)胞通過活化的caspase 1產(chǎn)生IL-6和IL-1β，從而觸發(fā)CRS。闡明這種分子機制為CRS嚴(yán)重程度與CAR-T細(xì)胞在治療期間的數(shù)量和B白血病細(xì)胞負(fù)荷有關(guān)的臨床觀察提供了深刻的見解。
在人類B白血病細(xì)胞、MCF-7乳腺癌細(xì)胞和小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞中檢測到GSDME表達是出乎意料的，這是因為它作為一種孔形成蛋白發(fā)揮作用，而且它的激活是潛在危險的，并且可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。據(jù)報道，GSDME在許多受檢的腫瘤細(xì)胞系中不表達。與此相一致的是，GSDME基因的啟動子區(qū)域顯示出高甲基化狀態(tài)，這就表明GSDME基因在細(xì)胞中遭受表觀遺傳沉默。 GSDME被認(rèn)為是一種通過caspase 3裂解誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的腫瘤抑制基因，并且腫瘤細(xì)胞可能已進化出表觀遺傳學(xué)手段來沉默GSDME表達，從而允許腫瘤發(fā)生。然而，GSDME在B白血病細(xì)胞和其他腫瘤細(xì)胞中的高表達提示著GSDME很可能在腫瘤細(xì)胞的孔形成中發(fā)揮替代作用。人們目前正在研究GSDME表達克服高甲基化調(diào)控的方式以及GSDME是否具有除孔形成以外的常規(guī)功能。
這項研究的重要發(fā)現(xiàn)是CAR-T細(xì)胞比未轉(zhuǎn)導(dǎo)的天然T細(xì)胞釋放更多的穿孔素/粒酶B。T細(xì)胞釋放溶細(xì)胞性效應(yīng)分子取決于兩種信號的激活：MHC-抗原肽-TCR（信號1）和CD80/CD86-CD28（信號2）。信號2的完全激活取決于TCR信號的激活強度。TCR信號激活的輕鏈激酶（LCK）使得CD28酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化；與此同時，TCR信號激活的LAT和SLP-76磷酸化和激活關(guān)鍵的CD28下游信號分子PLC-γ，因而將磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸（PIP2）降解為二酰甘油（DAG）和1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）。
基于對T細(xì)胞激活的了解和基因工程取得的進步，這些研究人員設(shè)計出針對人類T細(xì)胞的合成CAR。設(shè)計CAR的基本概念是將單鏈可變區(qū)片段（scFv）與CD3ζ細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊連接在一起，以在抗原結(jié)合后誘導(dǎo)T細(xì)胞激活。當(dāng)前，這種模塊化結(jié)構(gòu)已從單個CD3ζ信號結(jié)構(gòu)域擴展到CD3ζ-CD28、CD3ζ–4-1BB或CD3ζ–CD28–4-1BB信號結(jié)構(gòu)域，以模擬信號1和信號2。
鑒于CAR與其抗原之間的親和力可能比TCR與MHC-肽復(fù)合物之間的親和力高100倍，因此這種優(yōu)越的親和力加上共刺激信號使得CAR-T細(xì)胞能夠釋放大量的穿孔素/粒酶B，這是CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞焦亡所必需的。一旦進入細(xì)胞質(zhì)后，顆粒酶B可以將caspase 3的無活性前體（procaspase 3）裂解為它的活性形式?；罨腸aspase 3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或裂解GSDME，這種裂解通過膜孔形成觸發(fā)細(xì)胞焦亡。但是，細(xì)胞具有快速修復(fù)質(zhì)膜中形成的孔的能力。GSDME是否觸發(fā)細(xì)胞焦亡取決于膜孔形成與膜修復(fù)之間的平衡。盡管具有相同的GSDME數(shù)量，但是天然的TCR CD8+ T 細(xì)胞僅導(dǎo)致低水平的GSDME裂解，而CAR-T細(xì)胞釋放出更高水平的穿孔素/粒酶B，因而導(dǎo)致更多的GSDME激活。
由于釋放富含損傷相關(guān)分子模式（DAMP）分子的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物，細(xì)胞焦亡中發(fā)生的裂解具有高度促炎性。在這項研究中，這些研究人員證實腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷的細(xì)胞焦亡導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中的caspase 1和GSDMD激活，從而導(dǎo)致大量促炎細(xì)胞因子的釋放和CRS的發(fā)生。在這些促炎細(xì)胞因子中，IL-6和IL-1β尤為重要。臨床上，中和IL-6的抗體被廣泛用于預(yù)防和/或治療接受CAR-T細(xì)胞治療的患者中發(fā)生的CRS。作為多效細(xì)胞因子，IL-6主要受到NF-κB、AP-1和STAT3等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。諸如脂多糖（LPS）之類的病原體相關(guān)分子模式（PAMP）分子和諸如熱休克蛋白（HSP）和HMGB1之類的DAMP分子可通過激活這些轉(zhuǎn)錄因子來刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。
這些研究人員發(fā)現(xiàn)HMGB1存在于焦亡細(xì)胞（經(jīng)歷細(xì)胞焦亡的細(xì)胞）的上清液中，因而直接激活巨噬細(xì)胞中的IL-6。 IL-1β是以前體形式合成的，它的釋放取決于caspase 1的激活，caspase 1是一種受到炎性體嚴(yán)格調(diào)節(jié)的促炎性半胱天冬酶。炎性體NLRP3已被包括微生物毒素、顆粒物、晶體、β-淀粉樣蛋白聚集物或細(xì)胞外ATP在內(nèi)的多種刺激物廣泛激活。
在這項研究中，這些研究人員發(fā)現(xiàn)焦亡細(xì)胞的上清液含有ATP，用P2X7受體拮抗劑處理或降解ATP可抑制焦亡細(xì)胞的上清液激活巨噬細(xì)胞中caspase 1的能力。在他們開發(fā)的小鼠CRS模型的幫助下，他們進一步證實不論是敲除靶腫瘤細(xì)胞中的GSDME，也不論是剔除巨噬細(xì)胞，還是抑制caspase 1/GSDMD都可阻止CRS的發(fā)生。闡明這種分子途徑對于更好地了解與CAR-T細(xì)胞療法相關(guān)的毒性至關(guān)重要。2018年，Verena Staedtke等人已發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺阻斷劑可以抑制巨噬細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子。因此，對GSDME和兒茶酚胺的聯(lián)合阻斷可以在不降低腫瘤清除的情況下更好地治療CRS。
盡管這項研究報道CAR-T細(xì)胞通過GSDME依賴性途徑誘導(dǎo)靶腫瘤細(xì)胞遭受細(xì)胞焦亡，但也可能存在其他途徑來介導(dǎo)CAR-T細(xì)胞引起的靶細(xì)胞焦亡。近期研究已報道CAR-T細(xì)胞可能動員TNF-α來介導(dǎo)這種殺傷過程，不過這可能與顆粒酶B和穿孔素?zé)o關(guān)。這項發(fā)現(xiàn)的一種可能性是CAR-T細(xì)胞可以使用一種兩步驟策略來攻擊靶細(xì)胞。顆粒酶B和穿孔素引發(fā)了一波殺傷，如果靶細(xì)胞逃脫了一波攻擊，那么TNF-α就會發(fā)起第二波殺傷。這也可能解釋了為何細(xì)胞焦亡可在不顯著影響CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷作用的情況下可被阻斷。當(dāng)前的這項研究揭示了CAR-T細(xì)胞和天然的TCR-T細(xì)胞導(dǎo)致的細(xì)胞死亡類型之間存在機制上的差異，這就為通過將腫瘤細(xì)胞死亡從細(xì)胞焦亡切換到細(xì)胞凋亡來修飾CAR以減少CRS提供了機會。（生物谷 Bioon.com）
參考資料：Yuying Liu et al. Gasdermin E–mediated target cell pyroptosis by CAR T cells triggers cytokine release syndrome. Science Immunology, 2020, doi:10.1126/sciimmunol.aax7969.
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