北京大學王殊/梁靜團隊發(fā)文：揭示三陰性乳腺癌藥物靶點和生物標志物
10月30日，北京大學王殊/梁靜團隊在期刊《Cell Reports》上在線發(fā)表題為“PD-L1-mediated immune evasion in triple-negative breast cancer is linked to the loss of ZNF652”的研究論文，研究揭示了PD-L1的調控機制，并支持將ZNF652作為乳腺癌免疫治療的潛在生物標志物和藥物靶點。
研究背景
近年來，免疫檢查點抑制劑（ICIs）的開發(fā)已經徹底改變了癌癥治療。在癌細胞利用的免疫逃逸機制中，程序性死亡配體-1（PD-L1）是一種I型跨膜蛋白，它與其受體PD-1結合，以抑制微環(huán)境中的T細胞活化。針對PD-L1-PD-1信號通路的拮抗抗體已被用于治療多種惡性腫瘤，包括黑色素瘤、非小細胞肺癌、腎癌和乳腺癌等等。然而，克服內源性和獲得性耐藥仍然是提高抗PD-L1-PD-1治療的響應率和持續(xù)時間的挑戰(zhàn)。PD-L1-PD-1阻斷療法的有效性與多個參數有關，包括PD-L1陽性率、腫瘤突變負荷和某些轉錄標志。然而，在不同的癌癥中，這些因素的可預測性各不相同。PD-L1-PD-1軸的調控機制需進一步研究。
PD-L1通常在造血細胞和血管內皮細胞中表達，但在許多類型的癌癥中常常出現過表達。PD-L1的上調可以被炎癥因子和多種致癌信號通路觸發(fā)。較強效的誘導PD-L1表達的細胞因子是干擾素γ（IFN-γ），其作用主要通過JAK-STAT-IRF1信號通路。在非小細胞肺癌和三陰性乳腺癌中，也可以通過激活EGFR、MYC或YAP/TAZ等多種致癌信號通路來誘導PD-L1的上調表達。然而，PD-L1是否存在內在的抑制機制尚不清楚。
鋅指蛋白652（ZNF652）是Krüppel C2H2型鋅指蛋白家族的成員之一。ZNF652位于染色體17q21.3區(qū)域，該區(qū)域在多種癌癥中頻繁發(fā)生等位基因喪失（LOH），同時還包含了重要的腫瘤抑制基因TP53和BRCA1。以前的研究已經表明，ZNF652與CBFA2T3相互作用，并在體外抑制乳腺癌細胞的增殖。ZNF652的功能異常也與其他惡性腫瘤，如外陰癌和前列腺癌有關聯。然而，ZNF652在腫瘤發(fā)生中的分子機制目前尚不清楚。
研究發(fā)現
在研究中，研究人員報告了鋅指蛋白652（ZNF652）是PD-L1的強效轉錄抑制因子。 ZNF652在各種癌癥中經常發(fā)生等位基因喪失（LOH）。更高的LOH率和缺乏雌激素誘導的轉錄導致在三陰性乳腺癌（TNBC）中抑制了ZNF652的表達。在機制上，ZNF652與NuRD轉錄共抑制復合物物理上相互作用，以抑制一組基因，包括PD-L1。 ZNF652的過表達抑制了PD-L1的轉錄，而ZNF652的缺失則上調了PD-L1的表達。在三陰性乳腺癌中失去ZNF652會釋放PD-L1介導的免疫逃逸，無論體外還是體內都能觀察到這種現象。在乳腺癌進展過程中，ZNF652表達逐漸減少，低水平的ZNF652與PD-L1表達升高、浸潤的CD8+T細胞較少以及三陰性乳腺癌預后不良相關。
ZNF652是乳腺癌細胞中PD-L1的強效轉錄抑制因子
為了探究ZNF652-PD-L1軸在乳腺癌發(fā)生中的功能，研究人員首先收集了一系列BRCA細胞系，以檢查ZNF652和PD-L1表達的相關性。免疫印跡顯示所有ER+ BRCA細胞表達的ZNF652水平明顯高于ER-細胞，并且PD-L1的表達與ZNF652呈負相關。與MCF-7細胞的結果一致，對MDA-MB-231細胞進行的RT-qPCR和免疫印跡分析也顯示，在ZNF652敲除后，PD-L1明顯上調。同時，在另一種ZNF652表達較低且轉染效率較高的TNBC細胞系BT549中，外源性表達ZNF652顯著降低了PD-L1的表達。重要的是，qChIP實驗表明，在BT549細胞中ZNF652的過表達導致其在PD-L1啟動子上的富集增加，以及NuRD成分MTA3和HDAC1的富集。
qRT-PCR和免疫印跡分析顯示，使用特異性siRNA敲除MTA3或HDAC1完全消除了ZNF652介導的PD-L1轉錄抑制，支持NuRD復合物對ZNF652的抑制功能是必不可少的。IFN-γ是刺激PD-L1表達的主要細胞因子。為了檢查ZNF652是否參與了IFN-γ刺激的PD-L1表達，研究人員用或不用IFN-γ處理穩(wěn)定敲除ZNF652的MDA-MB-231細胞或穩(wěn)定過表達ZNF652的BT549細胞。結果顯示，盡管在存在或缺乏IFN-γ處理條件下敲除ZNF652都導致PD-L1的顯著上調，但在這些條件下，上調程度相似。在BT549細胞中過表達ZNF652抑制了PD-L1的表達，但仍對IFN-γ處理產生響應。這些數據表明，ZNF652介導的基因抑制和IFN-γ介導的基因激活是通過不同的途徑進行的。
為了證明ZNF652介導的PD-L1轉錄抑制在功能上具有相關性，研究人員接下來使用流式細胞術分析了ZNF652 KO MCF-7細胞、siZNF652處理的MDA-MB-231細胞、ZNF652過表達的BT549細胞及其相應對照中PD-L1在細胞膜上的水平。結果證實，ZNF652抑制了與細胞膜相關的PD-L1的表達，這主要通過與周圍淋巴細胞上的PD-1結合，從而導致腫瘤細胞免疫逃逸。重要的是，在BT549細胞中敲除HDAC1或MTA3都消除了ZNF652過表達引起的PD-L1抑制作用，支持這些因子對于ZNF652的抑制功能是必需的。接下來，研究人員將對照的BT549細胞或過表達ZNF652的BT549細胞與活化的CD8+效應T細胞進行共培養(yǎng)。這些T細胞是從健康供體的外周血單個核細胞中分離出來的，并通過抗CD3 / CD28和IL-2處理進行活化。
使用RayBio人類細胞因子抗體芯片對這兩種細胞群體的上清液進行了細胞因子分析。結果表明，ZNF652的過表達導致一系列細胞因子的顯著增加，如IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-12、IL-15、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和TNF-β，表明共培養(yǎng)中T細胞活性增強。具體而言，研究人員在MDA-MB-231細胞中進行了ELISA實驗，該細胞與活化的Jurkat T細胞共培養(yǎng)。結果顯示，ZNF652的敲除抑制了Jurkat細胞的IL-2產生，同時PD-L1的同時敲除可以拯救這種作用。此外，通過活細胞計數評估T細胞殺傷活性發(fā)現，在MDA-MB-231細胞中敲除ZNF652導致T細胞殺傷活性降低，而同時敲除PD-L1則使其恢復正常。相反地，在BT549細胞中過表達ZNF652增強了T細胞的殺傷活性，而同時敲除HDAC1或MTA3則減輕了這種效應。綜上所述，這些實驗證明ZNF652抑制了體外乳腺癌細胞通過PD-L1介導的免疫逃逸。
研究結果
綜上所述，研究揭示了PD-L1的調控機制，并支持將ZNF652作為乳腺癌免疫治療的潛在生物標志物和藥物靶點。
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