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  上海交大發(fā)文：揭示癌癥免疫治療新靶點
  
  2024-08-14 來源：轉(zhuǎn)化醫(yī)學網(wǎng)
  
  8月8日，上海交通大學研究團隊在期刊《Advanced Science》上發(fā)表了研究論文，題為“PTBP3 Mediates IL-18 Exon Skipping to Promote Immune Escape in Gallbladder Cancer”，本研究中，研究人員結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫和GBC mRNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)剪接因子聚嘧啶區(qū)域結(jié)合蛋白3 (PTBP3)在GBC中高表達。多組學分析顯示，PTBP3促進了白細胞介素-18 (IL-18)的外顯子跳躍，導致ΔIL-18的表達，這是一種腫瘤特異性表達的亞型。ΔIL-18通過下調(diào)CD8+T細胞中FBXO38的轉(zhuǎn)錄水平來減少PD-1泛素介導的降解，從而促進GBC免疫逃逸。通過HuPBMC小鼠模型，研究人員證實了PTBP3和ΔIL-18在促進GBC生長中的作用，并表明阻斷ΔIL-18產(chǎn)生的反義寡核苷酸顯示出抗腫瘤活性。此外，H3K36me3通過MRG15募集PTBP3促進IL-18外顯子跳躍，從而耦合IL-18轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接過程。特別是，研究還發(fā)現(xiàn)H3K36甲基轉(zhuǎn)移酶SETD2與hnRNPL結(jié)合，從而干擾PTBP3與IL-18前體mRNA的結(jié)合?？偟膩碚f，本研究為異常的選擇性剪接機制如何影響免疫逃逸提供了新的見解，并為改善GBC免疫治療提供了潛在的新視角。
  
  背景知識
  
  膽囊癌雖然是膽道系統(tǒng)的高度惡性腫瘤，但由于缺乏典型的臨床癥狀和早期診斷工具，往往診斷較晚。目前膽囊癌手術(shù)切除是公認的治療方法，但能夠進行手術(shù)治療的患者很少，各種輔助治療方式的療效有限。因此，有必要更深入地闡明膽囊癌的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點。
  
  在高等真核生物中，遺傳信息從DNA到成熟mRNA的傳遞通常需要前體mRNA的剪接。大多數(shù)含有內(nèi)含子的基因經(jīng)歷簡單的內(nèi)含子剪接和外顯子連接，這一過程被稱為組成性剪接。選擇性剪接提供了額外的基因調(diào)控模式，可以顯著增加轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，增強蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能多樣性。雖然許多蛋白質(zhì)的不同剪接亞型在正常條件下是有益的，但在病理條件下的選擇性剪接可能會導致有害影響。例如，在腫瘤組織中，廣泛的選擇性剪接異常已被證明有助于腫瘤進展。選擇性剪接主要有5種方式，其中外顯子跳躍是常見的。選擇性剪接相關(guān)rna結(jié)合蛋白(RBPs)在腫瘤發(fā)生過程中調(diào)節(jié)選擇性剪接事件中發(fā)揮重要作用。例如，DDX17可調(diào)節(jié)選擇性剪接產(chǎn)生促肝癌轉(zhuǎn)移的PXN-AS1致癌亞型。此外，之前的研究表明，一個不含POU結(jié)構(gòu)域的八聚體結(jié)合蛋白通過增強DLG1的致癌RNA剪接促進膽囊癌細胞增殖。然而，研究人員對膽囊癌中選擇性剪接異常的認識還遠遠不夠。
  
  PTBP3通過ΔIL-18促進膽囊癌免疫逃逸
  
  基于12例膽囊癌患者的mRNA-seq數(shù)據(jù)，研究人員采用Spearman分析探討PTBP3與免疫細胞浸潤的關(guān)系。如圖1A所示，NK細胞和CD8+T細胞與PTBP3表達呈顯著負相關(guān)。CD8+T細胞是參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要免疫細胞，在腫瘤細胞免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。PTBP3的表達與CD8+T細胞浸潤呈負相關(guān)，而IL-18 PSI值與CD8+T細胞浸潤呈正相關(guān)。基于這些結(jié)果，研究人員使用了腫瘤細胞和CD8+T細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，表明在腫瘤細胞中PTBP3敲低增強了CD8+T細胞的抗腫瘤作用。ELISA檢測結(jié)果顯示，與敲低PTBP3的NOZ和ZJU-0430細胞共培養(yǎng)后，CD8+T細胞產(chǎn)生更多的顆粒酶B和IFNγ。免疫檢查點的失調(diào)在許多惡性腫瘤的免疫逃避中起著重要作用。其中，PD-1 /PD-L1軸的破壞被證明與腫瘤進展顯著相關(guān)。mRNA-seq分析結(jié)果顯示，在12例配對的膽囊癌標本中，PTBP3與PD-L1的表達無顯著相關(guān)性，但與PD-1的表達呈正相關(guān)。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果顯示，在CD8+T細胞共培養(yǎng)體系中，敲低膽囊癌細胞PTBP3對PD-L1的表達無明顯影響，但顯著降低了CD8+T細胞中PD-1的表達。接下來，研究人員構(gòu)建了HuPBMC小鼠模型，在體內(nèi)研究PTBP3在膽囊CD8+T細胞抗腫瘤功能和免疫治療敏感性中的作用。通過流式細胞術(shù)對HuPBMC小鼠模型進行驗證，證實小鼠體內(nèi)人CD45+細胞的百分比大于60%。體內(nèi)實驗表明，通過皮下腫瘤體積和質(zhì)量測量，PTBP3敲低顯著抑制HuPBMC腫瘤生長，并提高膽囊癌免疫治療的敏感性。此外，研究人員對皮下腫瘤進行了mIHC，發(fā)現(xiàn)在PTBP3敲低組中浸潤的CD8+T細胞比對照組更多。相反，在NOG小鼠皮下腫瘤模型中，PTBP3敲低后對腫瘤生長沒有顯著影響，表明PTBP3敲低介導的抗腫瘤效應(yīng)是CD8+T細胞依賴的。
  
  圖1：PTBP3通過ΔIL-18促進膽囊癌免疫逃逸
  
  為了研究PTBP3是否通過ΔIL-18介導膽囊癌免疫逃逸，研究人員在腫瘤細胞中過表達PTBP3，并用ASO4處理腫瘤細胞以減少ΔIL-18的產(chǎn)生。流式細胞術(shù)分析顯示，ASO4部分逆轉(zhuǎn)了PTBP3過表達引起的細胞凋亡抑制。ELISA檢測結(jié)果也表明ASO處理能夠挽救PTBP3過表達導致的CD8+ T細胞顆粒酶B和IFNγ分泌的減少。此外，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗顯示ASO4處理降低了CD8+T細胞中PD-1的表達，也降低了PTBP3誘導的PD-1表達的增加。使用HuPBMC小鼠模型進行的體內(nèi)實驗也證實，ASO4可減少PTBP3過表達引起的腫瘤進展，并顯示出顯著的抗腫瘤作用。mIHC結(jié)果顯示，ASO4治療增加了CD8+T細胞在腫瘤內(nèi)的浸潤，與CD8+T細胞的抗腫瘤作用相一致。在藥物安全性方面，ASO4處理的小鼠主要臟器(心、肝、腎、肺)未見明顯病理改變。綜上所述，ptbp3介導的促腫瘤作用是CD8+T細胞依賴的，ASO4可能在膽囊癌的治療中具有潛在價值。
  
  研究小結(jié)
  
  綜上所述，研究人員發(fā)現(xiàn)剪接因子PTBP3在膽囊癌中表達顯著上調(diào)，并與膽囊癌患者的預(yù)后相關(guān)。PTBP3對膽囊癌細胞的生物學行為無明顯影響，但通過促進IL-18外顯子跳躍促進腫瘤細胞的免疫逃逸。在機制上，通過外顯子跳躍產(chǎn)生的ΔIL-18通過降低FBXO38轉(zhuǎn)錄水平，減少了CD8+T細胞中PD-1泛素介導的降解。在選擇性剪接調(diào)控過程中，H3K36me3通過MRG15招募PTBP3促進外顯子跳躍，并偶聯(lián)IL-18轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接。同時，hnRNPL通過SHI結(jié)構(gòu)域與SETD2結(jié)合，通過抑制PTBP3與IL-18前體mRNA的結(jié)合來損害IL-18外顯子跳躍。本研究加深了對膽囊癌進展過程中異常選擇性剪接事件的認識，并為膽囊癌的免疫治療提供了新的治療靶點。
  
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