南京醫(yī)科大學合作發(fā)文：發(fā)現肝癌進展新機制
8月20日，南京醫(yī)科大學與上海交通大學以及天津中醫(yī)藥大學研究人員合作在期刊《Advanced Science》上發(fā)表了研究論文，題為“GJB2 Promotes HCC Progression by Activating Glycolysis Through Cytoplasmic Translocation and Generating a Suppressive Tumor Microenvironment Based on Single Cell RNA Sequencing”，在這項研究中，研究人員通過單細胞RNA測序發(fā)現，間隙連接蛋白β-2（GJB2）在惡性細胞中高度富集，并且GJB2表達水平越高，預后越差。與正常肝組織相比，HCC癌細胞中GJB2的定位發(fā)生了變化。在癌細胞中，GJB2傾向于位于細胞質和細胞核中，而在正常組織中，GJB2主要位于細胞膜上。GJB2與糖酵解有關，通過誘導IκBa的泛素化降解來促進NF-κB通路，激活HIF-1α/GLUT-1/PD-L1通路。此外，GJB2敲低可重塑腫瘤免疫微環(huán)境，丹酚酸 B可抑制GJB2的活性?？傊?，GJB2通過在細胞質中的轉位激活糖酵解，促進HCC進展，并產生抑制性腫瘤微環(huán)境。丹酚酸 B抑制GJB2的表達，增強抗PD1療法的敏感性，這可能為開發(fā)HCC的新型聯合治療策略提供啟示。
背景知識
肝癌雖然在癌癥類型中排名靠后，但卻是第三大死亡原因。值得注意的是，HCC占所有肝癌病例的80%。全球范圍內，2019年約有747000例HCC病例，較1990年增加了70%，該疾病導致了480000人死亡。對于HCC，早期診斷時的治療方案通常非常有效。然而，腫瘤復發(fā)仍然是一個重大挑戰(zhàn)?？捎玫闹委熌Ｊ桨ń泟用}化療栓塞術（TACE）、肝移植、消融療法和外科切除。不幸的是，由于該疾病的無癥狀性，大多數HCC患者在晚期才被發(fā)現。對于這些個體，系統(tǒng)性藥物通常是可行的選擇，因為手術替代方案可能不可行。
近年來，腫瘤免疫治療，尤其是免疫檢查點抑制劑(ICIs)的使用顯著改變了HCC的臨床管理。貝伐珠單抗和阿替利珠單抗聯合治療被證明比一線治療索拉非尼更有效。盡管取得了這些進展，肝癌仍然是具挑戰(zhàn)性的癌癥之一，由于其頻繁復發(fā)和耐藥。不幸的是，相當一部分HCC患者要么經歷了免疫相關的副作用，要么沒有從這些免疫療法中獲益。盡管如此，免疫治療的快速發(fā)展為HCC患者帶來了新的希望，但仍需進一步研究以提高治療的敏感性。
GJB2促進肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移
為了研究GJB2 mRNA對肝癌細胞的影響，研究人員設計了3條針對GJB2的shRNA序列，從而抑制GJB2 mRNA合成的來源。這些序列被用來下調肝癌細胞中GJB2的表達。隨后，采用qRT-PCR方法檢測GJB2的表達水平。值得注意的是，研究結果顯示sh1表現出較高的敲低效率。研究人員用sh1序列驗證GJB2蛋白的表達，發(fā)現在HCCLM3和Hep-3B細胞中，敲低GJB2后的蛋白表達低于對照sh-NC組。在CCK8和EdU實驗中，敲低GJB2抑制肝癌細胞增殖。在遷移實驗和劃痕實驗中，與對照組相比，sh-GJB2抑制相對遷移和侵襲率。
GJB2促進人癌細胞的體外增殖、侵襲和遷移
另外，研究人員對GJB2的膜蛋白區(qū)域進行突變，發(fā)現與WT組相比，細胞表型提示突變組更促進HCC的進展，包括增殖，侵襲和遷移。下調GJB2的表達，尤其是在細胞質和細胞核中的表達，可有效抑制肝癌的增殖、侵襲和遷移。這一發(fā)現為靶向GJB2治療HCC的潛在治療策略提供了希望。
可減緩HCC進展的丹酚酸 B
本研究通過計算機虛擬篩選人GJB2蛋白結構的胞外活性位點Site1，以獲得與靶蛋白結合能力強的小分子化合物。將MCE文庫中的化合物與靶蛋白Human GJB2進行對接后，綜合對接分數、脂溶性、水溶性評價，初步篩選出5個較優(yōu)化合物，分別為Militarine、丹酚酸B、Parishin B、VER-155008、RGX-104。
研究人員選擇丹酚酸B (Sal B)作為進一步研究的藥物。在蛋白質免疫印跡實驗中，研究人員發(fā)現Sal B可以抑制腫瘤細胞的NF-κB通路。在CCK8和EdU實驗中，Sal B抑制肝癌細胞增殖。在遷移實驗和劃痕實驗中，與對照組相比，Sal B抑制了相對遷移和侵襲率。說明丹酚酸B能抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移。研究人員將H22細胞注射到C57BL/6小鼠體內，第7天進行Sal B注射和抗PD1抗體治療，觀察其抗腫瘤能力。結果顯示，與抗PD1組相比，Sal B+抗PD1組的腫瘤體積和重量明顯減小。上述藥物驗證結果表明，Sal B可通過抑制GJB2活性增強抗PD1免疫治療的敏感性，證實了其在腫瘤免疫治療中的促進作用，并具有在HCC中臨床轉化的潛力。
研究小結
根據單細胞RNA測序結果，GJB2在HCC惡性細胞中高度富集，GJB2蛋白的更高表達表明預后更差。機制上，GJB2通過細胞質轉位激活糖酵解途徑，在腫瘤微環(huán)境中產生抑制性作用，促進HCC進展。丹酚酸 B有效地抑制了GJB2的活性，并增強了抗PD1療法的敏感性，這可能為開發(fā)HCC的新型聯合治療策略提供啟示。
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