免疫檢查點(diǎn)抑制劑（Immune checkpoint blockade, ICB）能夠破壞腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫監(jiān)視的逃逸，極大地改變腫瘤病人的治療模式 【1】。盡管基于免疫檢查點(diǎn)開(kāi)發(fā)的抑制劑藥物，如PD-1抗體，在多種腫瘤治療中取得良好療效，然而在臨床實(shí)驗(yàn)中仍有部分患者無(wú)法獲益，如基因組微衛(wèi)星穩(wěn)定（Microsatellite stable, MSS）的結(jié)直腸癌病人【1-3】。
之前，張澤民團(tuán)隊(duì)與合作者開(kāi)發(fā)了STARTRAC生物信息學(xué)方法，首次對(duì)結(jié)直腸癌單個(gè)浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞的特征及其動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了系統(tǒng)性地刻畫，發(fā)現(xiàn)并解析了基因組微衛(wèi)星穩(wěn)定和不穩(wěn)定病人的T細(xì)胞差異【4】。相關(guān)工作已于2018年10月29日，以“Lineage tracking reveals dynamic relationships of T cells in colorectal cancer”為題發(fā)表在Nature雜志上。
在腫瘤微環(huán)境中，除淋巴細(xì)胞外，髓系免疫細(xì)胞（Myeloid cell）作為主要的抗原提呈細(xì)胞在腫瘤免疫中同樣發(fā)揮重要的功能。多項(xiàng)靶向髓系免疫細(xì)胞如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor-associated macrophage, TAM）和樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cell, DC ）的治療策略已進(jìn)入臨床前試驗(yàn)。然而這些細(xì)胞在結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中的特征，其與T細(xì)胞等其他細(xì)胞的相互作用關(guān)系，以及其靶向藥物的作用機(jī)理尚未得到全面闡釋。
2020年4月16日，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、生命科學(xué)學(xué)院、北京未來(lái)基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心（CLS）張澤民課題組聯(lián)合美國(guó)安進(jìn)（Amgen）公司Jackon G. Egen、Yu Xin團(tuán)隊(duì)和北京大學(xué)人民醫(yī)院申占龍課題組在Cell上以Article形式發(fā)表了題為Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer的研究論文。該研究在單細(xì)胞水平對(duì)結(jié)直腸癌患者的腫瘤微環(huán)境，特別是浸潤(rùn)髓系細(xì)胞類群首次進(jìn)行了系統(tǒng)性的刻畫，分析了TAM和DC細(xì)胞的類群特征、譜系發(fā)育及其與T細(xì)胞和其他細(xì)胞間相互作用關(guān)系?；谝陨辖Y(jié)果，研究團(tuán)隊(duì)分別對(duì)接受anti-CSF1R抑制劑和anti-CD40激動(dòng)劑的小鼠模型進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，揭示了這兩種靶向髓系細(xì)胞的免疫治療策略潛在的作用機(jī)理。此項(xiàng)國(guó)際前列的開(kāi)創(chuàng)性工作，建立了結(jié)合腫瘤患者及小鼠模型的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組來(lái)研究腫瘤免疫治療的范例，可為人們研究其他疾病中免疫細(xì)胞以及開(kāi)發(fā)新的治療方案提供思路。
1. 結(jié)直腸癌腫瘤中浸潤(rùn)著兩群狀態(tài)迥異的巨噬細(xì)胞
研究人員首先使用10x及Smart-seq2兩種技術(shù)對(duì)從結(jié)直腸癌患者中收集的免疫和非免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從中鑒定出包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、先天性淋巴細(xì)胞（Innate lymphoid cell, ILC）、髓系細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等主要細(xì)胞類群及下屬的40個(gè)CD45+的免疫細(xì)胞類群和12個(gè)CD45-的非免疫細(xì)胞類群（圖1）。這些細(xì)胞亞群均具有特異性的表達(dá)特征，且在不同組織中呈現(xiàn)出不同的細(xì)胞類型富集特征。
圖1 整合結(jié)直腸癌患者和小鼠模型的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究思路
在對(duì)各細(xì)胞類群進(jìn)行功能注釋后，研究人員發(fā)現(xiàn)了一群富集于腫瘤內(nèi)的FCN1+的單核細(xì)胞樣細(xì)胞，并推測(cè)其可能是TAM細(xì)胞發(fā)育的前體，這與近期在小鼠模型上研究腸道組織巨噬細(xì)胞的發(fā)育模式相吻合【5】。研究者還發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以被分為SPP1+ TAM和C1QC+ TAM兩個(gè)具有不同發(fā)育來(lái)源 、不同細(xì)胞功能的細(xì)胞類群 （圖2）。應(yīng)用RNA velocity等多種譜系發(fā)育分析推斷，C1QC+ TAM可能通過(guò)IL1B+的巨噬細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，發(fā)揮細(xì)胞吞噬和抗原呈遞的功能；而SPP1+ TAM可能由NLRP3+的組織駐留巨噬細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，發(fā)揮促血管生成及促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的功能。值得注意的是，結(jié)合腸炎病人及健康受試者的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)【6】，研究人員首次分析發(fā)現(xiàn)，SPP1+ TAM特異性地富集在結(jié)直腸癌病人癌組織中，提示其可能在結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
圖2 結(jié)直腸癌浸潤(rùn)細(xì)胞亞型相互作用網(wǎng)絡(luò)及髓系免疫細(xì)胞發(fā)育路徑
2. 細(xì)胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)提示結(jié)直腸癌髓系細(xì)胞的不同功能
為了研究結(jié)直腸癌內(nèi)各細(xì)胞類群間的相互作用關(guān)系，研究人員利用Smart-seq2數(shù)據(jù)中各細(xì)胞類群的特征基因集及TCGA中結(jié)直腸癌的bulk樣本，對(duì)各細(xì)胞類群間的相關(guān)性進(jìn)行了 計(jì)算，并進(jìn)而在癌旁組織和腫瘤內(nèi)構(gòu)建出“相關(guān)性關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（Correlative network）”。從所構(gòu)建的細(xì)胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)中可以發(fā)現(xiàn)，TAM細(xì)胞和DC細(xì)胞與多的細(xì)胞類群發(fā)生相互作用，構(gòu)成了腫瘤內(nèi)相互作用網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn) （圖2）。值得注意的是，SPP1+ TAM和C1QC+ TAM也具有不同的細(xì)胞間作用關(guān)系，其中C1QC+ TAM主要與多種T細(xì)胞亞群發(fā)生相互作用，SPP1+ TAM則主要與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（Cancer-associated fibroblast，CAF）發(fā)生相互作用，這也與上述這兩群細(xì)胞的主要功能相對(duì)應(yīng)。兩群經(jīng)典的DC細(xì)胞（Conventional DC，cDC）分別與不同類型的T細(xì)胞相互作用。該研究中新建立的細(xì)胞間相互作用分析網(wǎng)絡(luò)，有助于深入理解免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的不同功能。
3. 結(jié)直腸癌病人及小鼠腫瘤模型中浸潤(rùn)的保守的免疫細(xì)胞亞型
基于以上針對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境的解析，研究人員接著利用小鼠腫瘤模型來(lái)研究靶向不同髓系細(xì)胞類群對(duì)抗腫瘤免疫反應(yīng)造成的影響。anti-CSF1R抑制劑和anti-CD40激動(dòng)劑是兩種已進(jìn)入前臨床實(shí)驗(yàn)階段的靶向髓系細(xì)胞的免疫治療策略【7,8】。其中CSF1R是促進(jìn)髓系細(xì)胞增殖和分化的重要受體，CD40則是TNF受體家族的成員，在DC細(xì)胞和T細(xì)胞間的信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要功能。研究者分別在MC38和Renca兩種小鼠模型中進(jìn)行了anti-CD40與anti-CSF1R的治療，并獲得小鼠腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。與以上結(jié)直腸癌病人相比，DC和T細(xì)胞亞群在人和小鼠腫瘤中均有較高的一致性，如研究團(tuán)隊(duì)此前發(fā)現(xiàn)的激活的LAMP3+ DC【9】和BHLHE40+ Th1-like 細(xì)胞【4】。而盡管巨噬細(xì)胞在人鼠間的異質(zhì)性高于其他免疫細(xì)胞類群，但在小鼠腫瘤中也存在著與SPP1+ TAM和C1QC+ TAM相似的巨噬細(xì)胞亞群。
4. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組揭示anti-CSF1R抑制劑作用機(jī)制
研究人員進(jìn)而對(duì)治療前后各細(xì)胞亞群比例及轉(zhuǎn)錄組的變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)不同TAM細(xì)胞亞群對(duì)anti-CSF1R治療的敏感程度不同 （圖3）。Anti-CSF1R治療耐受的TAM細(xì)胞亞群與結(jié)直腸癌患者中的SPP1+ TAM具有較高的相似性，且會(huì)特異性地高表達(dá)與促血管生成相關(guān)的基因Vegfa以及參與免疫抑制過(guò)程的基因Cd274和Arg1。Anti-CSF1R阻斷型抗體會(huì)影響處在細(xì)胞周期中的巨噬細(xì)胞的增殖，并會(huì)特異性地刪除掉一定比例的具有C1QC+ TAM特征的巨噬細(xì)胞，卻不會(huì)對(duì)具有SPP1+ TAM特征的巨噬細(xì)胞起到作用，提示anti-CSF1R治療后保留了在腫瘤中具有促進(jìn)腫瘤血管生成的巨噬細(xì)胞。該研究對(duì)anti-CSF1R抑制劑在大部分腫瘤患者中單藥療效較差的原因給出了一個(gè)機(jī)制性解釋。
圖 3 靶向巨噬細(xì)胞的anti-CSF1R抑制劑作用機(jī)制
5. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組揭示anti-CD40抑制劑作用機(jī)制
Anti-CD40激動(dòng)劑治療可以使MC38小鼠的腫瘤體積縮小，且在與PD1阻斷劑聯(lián)合使用后還可以進(jìn)一步抑制腫瘤的生長(zhǎng)。然而，Anti-CD40激動(dòng)劑治療的機(jī)制及細(xì)胞亞群的變化有待深入闡釋。本研究結(jié)合結(jié)直腸癌腫瘤患者和小鼠模型單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，使用anti-CD40激動(dòng)劑對(duì)MC38小鼠進(jìn)行治療后的第2天，激活態(tài)的Ccl22+ cDC1細(xì)胞即迅速做出響應(yīng)，細(xì)胞比例顯著增加。同時(shí)，在人鼠間保守的Bhlhe40+ Th1細(xì)胞比例也顯著上升 （圖4）。使用研究組此前開(kāi)發(fā)的針對(duì)T細(xì)胞及其克隆性的分析方法STARTRAC【4】，研究人員發(fā)現(xiàn)anti-CD40激動(dòng)劑治療后，Bhlhe40+ Th1細(xì)胞的克隆增生顯著增強(qiáng)。有意思的是，Bhlhe40+ Th1細(xì)胞所表達(dá)的Cd40lg轉(zhuǎn)錄本比例在治療后也有顯著上升，提示著anti-CD40激動(dòng)劑治療可以通過(guò)促進(jìn)Bhlhe40+ Th1細(xì)胞表達(dá)更多的Cd40lg來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤中Bhlhe40+ Th1細(xì)胞與cDC1細(xì)胞間的相互作用。
相比CD4+ T細(xì)胞，CD8+ T細(xì)胞的響應(yīng)速度則較慢，僅在治療后的第10天，可以觀察到Ccl5+ Tem細(xì)胞和Cxcr6+ Trm細(xì)胞比例的顯著增加，值得注意的是，Tem細(xì)胞在淋巴結(jié)和腫瘤間的遷移能力，及該群細(xì)胞與Trm細(xì)胞間的轉(zhuǎn)換能力也在治療后有著顯著的提升，提示此群Tem細(xì)胞可能與Stem-like T細(xì)胞相似，具有補(bǔ)充池（Pool）的功能。
圖4 靶向DC細(xì)胞的anti-CD40激動(dòng)劑作用機(jī)制
該研究共同一作者北京大學(xué)博士后張雷博士（同時(shí)為Nature工作共同一作者）表示，“該工作對(duì)此前團(tuán)隊(duì)針對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞的研究有很好的延續(xù)性和前瞻性。此前研究中發(fā)現(xiàn)MSI結(jié)直腸癌病人中會(huì)富集一群BHLHE40+ Th1-like細(xì)胞，認(rèn)為可能是該類型患者免疫治療響應(yīng)更好的原因之一。而對(duì)于MSS病人的治療響應(yīng)仍缺乏認(rèn)識(shí)。在此項(xiàng)結(jié)合人鼠單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的工作中，團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)靶向DC的治療策略anti-CD40可以顯著地提高此類細(xì)胞的水平，為MSS病人的臨床治療策略提供一定的指導(dǎo)。而靶向TAM的藥物機(jī)制的研究，將大大有助于后續(xù)靶點(diǎn)的挖掘及新的治療策略的開(kāi)發(fā)?！?/span>
據(jù)悉，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心CLS博士后張雷博士，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生李子逸、Amgen公司Katarzyna M. Skrzypczynska博士為該論文的并列一作者，北京大學(xué)BIOPIC，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，ICG和CLS張澤民教授、Amgen科學(xué)家Jackson G. Egen博士和Xin Yu博士以及北京大學(xué)人民醫(yī)院胃腸外科申占龍教授為該論文的共同通訊作者。Amgen炎癥與腫瘤免疫部負(fù)責(zé)人歐陽(yáng)文軍博士對(duì)此研究提供了寶貴建議。
部分研究人員，從左到右：任仙文，張啟明，李子逸（共同一作），歐陽(yáng)文軍，高染染，張澤民（Lead通訊），張雷（共同一作），申占龍（共同通訊），房巧，胡學(xué)達(dá)
專家點(diǎn)評(píng)
葉幼瓊、蘇冰（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海市免疫學(xué)研究所）
腫瘤免疫療法，例如免疫檢查點(diǎn)阻斷療法（Immune checkpoint blockade，ICB），使得實(shí)體瘤治療有了革命性進(jìn)展，顯著提高了許多惡性腫瘤患者的長(zhǎng)期生存。但并不是所有腫瘤都對(duì)免疫療法有響應(yīng)，目前只有少部分腫瘤病人具有顯著療效。因此臨床上迫切需要找到免疫治療響應(yīng)與否的具體機(jī)制以及相應(yīng)的生物標(biāo)記，以提高免疫療法的效果。近年來(lái)，腫瘤微環(huán)境中的其它細(xì)胞成分，例如髓系細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞亞群對(duì)腫瘤免疫治療效果的影響也逐漸受到人們重視。CSF1R阻斷療法在多個(gè)癌種中可以抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞而增加CD8/CD4 T細(xì)胞的比例。然而，由于我們對(duì)腫瘤微環(huán)境復(fù)雜性的不完全了解，髓系細(xì)胞靶定治療在腫瘤中的具體作用以及機(jī)制并沒(méi)有被完全理解。
目前單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為探究細(xì)胞類群多樣性的有力手段，而不同的測(cè)序技術(shù)在細(xì)胞捕獲和基因捕獲效率上具有各自不同的優(yōu)勢(shì)。SMART-seq2測(cè)序技術(shù)利用孔板對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通量雖相對(duì)較低，但每個(gè)細(xì)胞的基因捕獲率相對(duì)較高；而10x Genomics測(cè)序技術(shù)利用基于微滴包被的原理，可實(shí)現(xiàn)一次實(shí)驗(yàn)獲得較多的細(xì)胞數(shù)量，有效降低了單細(xì)胞測(cè)序的實(shí)驗(yàn)成本。二者結(jié)合可以充分發(fā)揮不同數(shù)據(jù)類型的優(yōu)勢(shì)，獲得高分辨率的單細(xì)胞圖譜以研究腫瘤微環(huán)境在免疫治療中的作用。
4月16日，北京大學(xué)張澤民課題組結(jié)合SMART-seq2和10x Genomics兩種單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，于Cell在線發(fā)表了題為“Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer”的研究論文。通過(guò)分析腸癌病人的癌組織、癌旁組織和外周血的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，獲得高分辨率腸癌免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞圖譜。并揭示了單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的組織特異性，以及主要髓系細(xì)胞亞群在小鼠和人中的保守性。其中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）主要來(lái)源于特異腫瘤浸潤(rùn)的單核細(xì)胞樣細(xì)胞。區(qū)別于已知的M1和M2兩種巨噬細(xì)胞，TAM呈現(xiàn)兩種不同狀態(tài)，一種與炎癥相關(guān)（C1QC+ TAM），更傾向于和髓系細(xì)胞或T細(xì)胞相互作用；另一種與腸癌轉(zhuǎn)移、血管生成相關(guān)（SPP1+ TAM），更傾向于與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞相互作用。有意思的是，在小鼠實(shí)驗(yàn)中，SPP1+ TAM對(duì) CSF1R阻斷治療具有耐藥性，同時(shí)結(jié)腸癌病人中具有高浸潤(rùn)SPP1+ TAM和低浸潤(rùn)C(jī)1QC+ TAM都會(huì)有較差的預(yù)后，說(shuō)明CSF1R單藥治療并不能完全消除TAM的促進(jìn)腫瘤作用。其次作者確定腫瘤微環(huán)境中的三類樹(shù)突狀細(xì)胞（DC），包括LILRA4+ pDC、BATF3+ cDC1和CD1C+ cDC2，其中人的BATF3+ cDC1和小鼠的Ccl22+ cDC1/Clec9a+ cDC1保守，并意外發(fā)現(xiàn)BATF3+ cDC1同時(shí)和耗竭CD8 T細(xì)胞還有BHLHE40+ Th1樣細(xì)胞相互作用。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，作者發(fā)現(xiàn)CD40激動(dòng)劑治療能增加Ccl22+ cDC1細(xì)胞亞群比例而對(duì)其它DC亞群影響很小，并能同時(shí)增加效應(yīng)記憶T細(xì)胞數(shù)量而減少耗竭CD8 T細(xì)胞數(shù)量，誘導(dǎo)腫瘤中Bhlhe40+ Th1樣細(xì)胞的活化和擴(kuò)增。此研究也從單細(xì)胞層面解析了CD40激動(dòng)劑作用機(jī)制，為其和PD-1阻斷劑的聯(lián)合治療提供了理論基礎(chǔ)。
該工作全面地解析結(jié)腸癌的腫瘤微環(huán)境細(xì)胞圖譜，闡明細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，以髓系細(xì)胞為靶標(biāo)的CSF1R阻斷劑和CD40激動(dòng)劑的治療為例，揭示髓系細(xì)胞靶定治療的相關(guān)機(jī)制，對(duì)靶向腫瘤免疫微環(huán)境為基礎(chǔ)的腫瘤治療提供了更詳細(xì)的理論基礎(chǔ)，為今后靶定髓系細(xì)胞的精準(zhǔn)治療提供助力，具有重要的臨床轉(zhuǎn)化意義。針對(duì)該工作中CSF1R阻斷劑治療的耐受性，未來(lái)研究需要尋找調(diào)控SPP1+ TAM的一系列因子，設(shè)計(jì)合適抑制劑，并通過(guò)聯(lián)合治療的方式達(dá)到完全消除TAM。同時(shí)需要推動(dòng)基于髓系細(xì)胞的細(xì)胞療法的臨床實(shí)驗(yàn)及相關(guān)生物學(xué)機(jī)制研究，以其提高免疫治療療效。
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