在過去18個(gè)月里，有11項(xiàng)基因編輯研發(fā)項(xiàng)目在美國或歐盟進(jìn)入臨床開發(fā)階段，其中6項(xiàng)基于CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)?，F(xiàn)在基因編輯研發(fā)管線包括這一技術(shù)在體外基因編輯、癌癥免疫學(xué)和體內(nèi)基因編輯方面的應(yīng)用。近日，Nature Reviews Drug Discovery上發(fā)表的一篇綜述對基因編輯的研發(fā)管線進(jìn)行了深度盤點(diǎn)。如CRISPR技術(shù)先驅(qū)之一，加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer Doudna教授所說，“現(xiàn)在是令人興奮的時(shí)代！”
多種基因編輯技術(shù)平臺進(jìn)入臨床開發(fā)階段
提到基因編輯技術(shù)，人們可能首先想到的是CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通過使用向?qū)NA（guide RNA），讓Cas酶能夠識別基因組中的特定序列，從而對DNA或RNA序列進(jìn)行精準(zhǔn)的切割。CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)因?yàn)樗暮啽愫涂删幊绦裕趩柺酪院缶偷玫搅藢W(xué)術(shù)界和研發(fā)界的廣泛應(yīng)用。
然而，基因編輯的工具并不只有CRISPR。目前，多項(xiàng)基于其它基因編輯技術(shù)平臺的研發(fā)項(xiàng)目也已經(jīng)進(jìn)行臨床開發(fā)階段。其中之一是鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFNs），這類核酸內(nèi)切酶并不依靠RNA，而是依靠鋅指蛋白來識別特定DNA序列。Sangamo公司在開發(fā)基于鋅指核酸酶的基因編輯系統(tǒng)方面積累了很多經(jīng)驗(yàn)。由于需要對鋅指蛋白進(jìn)行修改來改變ZFN的靶向序列特異性，基于鋅指核酸酶的基因編輯系統(tǒng)沒有CRISPR基因編輯系統(tǒng)那么簡便。然而，ZFN基因編輯系統(tǒng)也有自己的優(yōu)勢。例如，它并不是源于細(xì)菌的蛋白，因此在人體中使用時(shí)可能更不容易激發(fā)人體的免疫反應(yīng)。而且，ZFN識別DNA序列的蛋白域與其它基因編輯系統(tǒng)相比更小，更容易裝進(jìn)遞送基因編輯系統(tǒng)的載體之中。
▲不同基因編輯系統(tǒng)核酸序列識別亞基大?。▓D片來源：參考資料[2]）
除了CRISPR和鋅指核酸酶以外，其它的基因編輯技術(shù)平臺包括TALEN，大范圍核酸酶（meganulease），以及綜合TALEN和大范圍核酸酶構(gòu)建的megaTAL技術(shù)。它們都存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)，也可以不同的應(yīng)用場景下發(fā)揮作用。
體外基因編輯研發(fā)管線
初的基因編輯研發(fā)項(xiàng)目聚焦于在體外對細(xì)胞進(jìn)行編輯。從新技術(shù)開發(fā)的角度來講這并不意外，在體外對細(xì)胞的基因組進(jìn)行編輯，可以避開困擾基因編輯的多種障礙。以CRISPR為例，基因編輯的一個(gè)主要障礙是如何將較大的基因編輯系統(tǒng)遞送到細(xì)胞內(nèi)部，而體外基因編輯可以使用電穿孔技術(shù)打開細(xì)胞膜這一屏障，讓基因編輯系統(tǒng)比較容易地進(jìn)入細(xì)胞。
CRISPR基因編輯技術(shù)需要克服的另外兩個(gè)難關(guān)是防止基因編輯的“脫靶效應(yīng)”和Cas蛋白產(chǎn)生的免疫原性。而在體外對細(xì)胞進(jìn)行基因編輯可以繞開人體的免疫應(yīng)答問題，并且可以對編輯后的細(xì)胞進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)和清除出現(xiàn)“脫靶效應(yīng)”的細(xì)胞。提高潛在療法的安全性。
目前，體外基因編輯研發(fā)項(xiàng)目主要聚集于血紅蛋白疾病和癌癥免疫學(xué)兩大領(lǐng)域。無論是血紅蛋白疾病還是血液癌癥，已有的基因療法和細(xì)胞療法的成功已經(jīng)為開發(fā)基于基因編輯的創(chuàng)新療法鋪平了道路。同時(shí)，它們也代表著患者未被滿足的醫(yī)療需求。
在血紅蛋白疾病方面，數(shù)項(xiàng)治療鐮狀細(xì)胞貧血（SCD）和β地中海貧血的基因編輯項(xiàng)目已經(jīng)進(jìn)入臨床開發(fā)階段。其中，Sangamo和賽諾菲聯(lián)合開發(fā)的ST-400/BIVV003使用ZFN基因編輯系統(tǒng)對從患者體內(nèi)獲得的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（HSPCs）進(jìn)行基因編輯，通過對BCL11A基因的編輯讓細(xì)胞能夠重新表達(dá)胎兒血紅蛋白。去年在ASH年會上公布的初步數(shù)據(jù)表明，接受改造過的HSPCs治療的三名患者中有兩名患者的胎兒血紅蛋白水平顯著提高。
CRISPR Therapeutics和Vertex公司聯(lián)合開發(fā)的CTX001使用CRISPR系統(tǒng)靶向同樣的BCL11A基因。去年該公司公布了CTX001在一名嚴(yán)重鐮狀細(xì)胞貧血患者和一名β地中海貧血患者中的療效。兩名患者的臨床癥狀都有改善。
在癌癥免疫療法方面，CAR-T療法的獲批和它們在治療血液癌癥方面的成功，不但為對T細(xì)胞進(jìn)行基因編輯打下了良好的基礎(chǔ)，也為基因編輯技術(shù)找出了一個(gè)很好的應(yīng)用領(lǐng)域。CAR-T細(xì)胞通過將抗原嵌合受體（CAR）通過基因工程表達(dá)在T細(xì)胞表面，讓T細(xì)胞成為攻擊腫瘤的武器。然而，T細(xì)胞中原本存在的天然T細(xì)胞受體可能影響CAR-T細(xì)胞的療效，并且T細(xì)胞還受到多種免疫抑制和調(diào)控機(jī)制的影響，導(dǎo)致它們功能失常或出現(xiàn)衰竭。
基因編輯技術(shù)提供了一種進(jìn)一步改進(jìn)CAR-T療法的策略。在2019年，賓夕法尼亞大學(xué)的CAR-T療法先驅(qū)Carl June博士與合作伙伴一起，使用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除了T細(xì)胞中的內(nèi)源T細(xì)胞受體和表達(dá)PD-1的基因。然后，他們將識別NY-ESO-1抗原（一種在多種腫瘤組織中高度表達(dá)的抗原）的T細(xì)胞受體表達(dá)在這些T細(xì)胞中。今年2月，研究團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)》雜志上發(fā)表了研究的初步結(jié)果。初步結(jié)果表明，經(jīng)過基因編輯的T細(xì)胞沒有導(dǎo)致與治療相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)，而且顯示出持久的存活和擴(kuò)增能力。
目前在癌癥免疫療法的研發(fā)管線中，基因編輯技術(shù)被用于進(jìn)一步改善靶向CD19或BCMA抗原的CAR-T療法，以及對同種異體細(xì)胞療法進(jìn)行改造，防止同種異體的T細(xì)胞對宿主組織進(jìn)行攻擊。
體內(nèi)基因編輯研發(fā)管線
體內(nèi)基因編輯療法需要將基因編輯系統(tǒng)送入患者體內(nèi)，在體內(nèi)完成對基因組中特定序列的編輯。與體外基因編輯相比，它需要克服更多障礙，而它的應(yīng)用領(lǐng)域也更為多樣化。
例如，由知名學(xué)者張鋒博士聯(lián)合創(chuàng)建的Editas Medicine和艾爾建在今年完成首例CRISPR體內(nèi)基因編輯療法的患者給藥。這款名為EDIT-101（又名AGN-151587）的在研療法使用腺相關(guān)病毒，將CRISPR基因編輯系統(tǒng)導(dǎo)入患者的視網(wǎng)膜細(xì)胞中，切除或逆轉(zhuǎn)導(dǎo)致Leber先天性黑朦10的CEP290基因上的致病突變。
眼睛為檢驗(yàn)體內(nèi)基因編輯療法提供了一個(gè)良好的環(huán)境，因?yàn)檠劬儆诿庖咛貦?quán)（immunoprivileged）部位，在眼中引入外來蛋白不容易引起免疫反應(yīng)，而且眼睛向身體其它部位的血液循環(huán)有限，降低基因編輯系統(tǒng)對其它組織進(jìn)行編輯的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，被基因編輯的細(xì)胞不會更新?lián)Q代，可能提高基因編輯的長期效果。
今年1月，Locus Biosciences公司宣布，啟動1b期臨床研究，檢驗(yàn)其武裝了CRISPR-Cas3基因編輯系統(tǒng)的噬菌體crPhage，靶向?qū)е履虻栏腥镜拇竽c桿菌時(shí)的效果。噬菌體是自然界中天然以細(xì)菌為食的病毒，然而很多噬菌體殺傷細(xì)菌的能力并不算強(qiáng)。Locus Biosciences公司提高噬菌體殺傷力的辦法是給它們裝上CRISPR-Cas3的武器。Cas3與通常的Cas9不同，它一旦識別細(xì)菌基因組中的特定序列，會將附近的所有序列切碎，從而達(dá)到消滅細(xì)菌的效果。在臨床前研究中，這一攜帶CRISPR-Cas3的噬菌體在體外培養(yǎng)和尿道感染的小動物模型中都顯示出更好的殺菌效果。
在基因編輯研發(fā)管線中，很多項(xiàng)目治療的疾病為罕見病，這是由于作為一種新興技術(shù)，基因編輯的安全性尚未得到完全驗(yàn)證，因此，在治療沒有已有療法的罕見病患者時(shí)的收益/風(fēng)險(xiǎn)比更為合理。不過，隨著更多的臨床試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證它的安全性，基因編輯技術(shù)有可能向患者人數(shù)更多的大眾病擴(kuò)展。
展望未來
在今明兩年，多項(xiàng)基因編輯臨床項(xiàng)目將公布結(jié)果。這些臨床結(jié)果將對基因編輯療法的短期未來走向產(chǎn)生很大的影響。同時(shí)，研究人員已經(jīng)在進(jìn)一步豐富基因編輯的“工具箱”方面取得了重要進(jìn)步。例如，Broad研究所的劉如謙（David Liu）教授基于CRISPR基因編輯系統(tǒng)，開發(fā)出單堿基編輯器，能夠?qū)⒒蛐蛄兄械娜魏螇A基修改成其它堿基。這一單堿基編輯系統(tǒng)能夠用于治療多種因?yàn)閱螇A基突變導(dǎo)致的遺傳性疾病。
對基因編輯系統(tǒng)的另一個(gè)研發(fā)方向是利用它識別基因組序列的能力，不去切斷DNA序列，而是讓它攜帶能夠調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。例如，CRISPR-dCas9系統(tǒng)沒有切割DNA序列的活性，但是它可以與調(diào)節(jié)基因表達(dá)的效應(yīng)子融合，調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)。Navega Therapeutics公司希望利用這一工具沉默Nav1.7離子通道的表達(dá)，從而阻斷傳遞痛覺信號的通路。
Sangamo公司在去年年底召開的研發(fā)日活動中，也著重強(qiáng)調(diào)了鋅指蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合（ZFN-TF），可以產(chǎn)生精準(zhǔn)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的工具。該公司還指出，將鋅指蛋白與不同效應(yīng)子相結(jié)合，可以產(chǎn)生行使多種不同功能的基因組調(diào)控工具。
▲鋅指蛋白與不同效應(yīng)子結(jié)合可以產(chǎn)生多種功能（圖片來源：參考資料[2]）
基因編輯技術(shù)問世以來，人們對它能夠?yàn)橹委熂膊砟男└镄伦龀隽撕芏嘣O(shè)想。在經(jīng)過多年的努力之后，展現(xiàn)基因編輯療法潛力的臨床試驗(yàn)結(jié)果即將在不久的未來公布，讓我們拭目以待！
參考資料：
[1] Gene-editing pipeline takes off. Retrieved May 19, 2020, from https://www.nature.com/articles/d41573-020-00096-y
[2] Sangamo R&D Day Presentation. Retrieved May 19, 2020, from https://investor.sangamo.com/static-files/e29a38f9-b55b-49c0-b9e5-5240c2165cfd
[3] Locus Biosciences initiates world’s first controlled clinical trial for a CRISPR enhanced bacteriophage therapy. Retrieved May 19, 2020, from https://www.locus-bio.com/media/locus-biosciences-initiates-worlds-first-controlled-clinical-trial/
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